© М.А. Старостина, З.А. Афанасьева, Р.А., Старостин, 2021
УДК 616.34/.35-006.04-07
М.А. Старостина1, З.А. Афанасьева2, Р.А., Старостин3
1ГАУЗ «Республиканский клинический онкологический диспансер МЗ РТ», г. Казань
2Казанская государственная медицинская академия ― филиал ФГБОУ ДПО РМАНПО МЗ РФ, г. Казань
3ФГБОУ ВО «Казанский государственный медицинский университет» МЗ РФ, г. Казань
Афанасьева Зинаида Александровна ― доктор медицинских наук, профессор кафедры онкологии, радиологии и паллиативной медицины Казанская государственная медицинская академия ― филиал ФГБОУ ДПО РМАНПО МЗ РФ
420012, г. Казань, ул. Бутлерова, д. 36, тел. +7-917-886-29-23, e-mail: z-afanasieva@mail.ru
Реферат
Цель ― в рамках данного анализа провести сравнение результатов собственных исследований по применению неинвазивных тестов MMP-9, TIMP-1, fTu M2-PK, гемокульттеста Hexagon OBTI, определяемых в копрофильтратах, и их комбинаций при диагностике и скрининге рака толстого кишечника.
Материал и методы. Материалом исследования послужили образцы кала, взятые до начала лечения у 63 больных колоректальным раком. Контрольная группа представлена 20 здоровыми. Скринингу были подвергнуты 1071 человек.
В качестве тестов использовались MMP-9, TIMP-1, fTu M2-PK, Hexagon OBTI. Уровень ММР-9 и TIMP-1 определяли методом ИФА с помощью наборов Quantikine ELISA (R&D Systems, USA), fTu M2-PK определяли иммуноферментными тест-системами ScheBo Tu M2-PKTM ELISA Stool Test (ScheBo Biotech AG, Германия), скрытую кровь в кале ― экспресс-анализом Hexagon OBTI (HUMAN, Германия). Определяли чувствительность, специфичность, точность данных тестов и их комбинации.
Результаты. В группе больных раком толстого кишечника уровни MMP-9 и TIMP1 в копрофильтратах были выше по сравнению с таковыми в группе здоровых и не зависели от стадии заболевания и локализации опухоли. Значение fTu M2-PK в копрофильтратах больных раком толстого кишечника не отличалось от значения данного маркера группы контроля. Данный тест оказался неинформативным. TIMP-1 и Hexagon OBTI с чувствительностью, специфичностью и точностью 76,2%, 95%, 80,7% и 86,2%, 93,8%, 87,7% соответственно оказались наиболее информативными тестами при диагностике колоректального рака. Комплексное применение молекулярного маркера TIMP-1 и гемокульттеста Hexagon OBTI позволило повысить их информативность при скрининге колоректального рака: чувствительность ― 100%, специфичность ― 97,3%, точность ― 97,3%.
Вывод. Информативность применения гемокульт-теста Hexagon OBTI в комбинации с TIMP-1 возрастает, что делает актуальным их совместное применение при скрининге рака толстого кишечника в качестве неинвазивных тестов.
Ключевые слова: рак толстого кишечника, молекулярные маркеры, Hexagon OBTI, диагностика, скрининг.
Введение
Во всем мире отмечается устойчивая тенденция к увеличению заболеваемости и смертности от колоректального рака [1]. Неуклонно растет и доля больных с распространенными формами колоректального рака. В 2018 году в России у 49,6% больных рак ободочной кишки был выявлен в III-IV стадии, а рак прямой кишки в той же стадии ― у 46,4% [2], поэтому является актуальным выявление ранних, клинически бессимптомных случаев колоректального рака с применением неинвазивных диагностических тестов. Поиск неинвазивных высокоинформативных тестов для раннего выявления колоректального рака остается важной проблемой молекулярной онкологии [3].
Большим достижением современной онкологии является открытие ряда маркеров прогрессирования колоректального рака [4-6].
Имеются немногочисленные работы, в которых авторы изучали MMP и TIMP в опухоли и здоровой слизистой толстой кишки, в сыворотке крови у больных колоректальным раком [7]. Обсуждается роль ММР-9 и TIMP-1 в опухолевой инвазии и метастазировании. Однако мы не встретили работ, в которых ММР и TIMP, определяемые в копрофильтратах, использовались бы в качестве диагностических маркеров колоректального рака.
По данным литературы, опухолевую пируваткиназу (fTu М2-РК) считают чувствительным маркером при раке толстой кишки [8, 9]. Другие авторы считают определение скрытой крови в кале иммунохимическим методом более информативным [10, 11]. Копро-тесты (гемокульттест, криптогемтест, гемафантест) отличаются различной степенью информативности, но их недостатком являются ложноположительные результаты [4, 12]. По мнению B.C. Kim и соавт., высокоинформативным является комплекс тестов calgranulin и теста на скрытую кровь (OC-sensor kit) [13].
Цель ― в рамках данного анализа провести сравнение результатов собственных исследований по применению неинвазивных тестов MMP-9, TIMP-1, fTu M2-PK, гемокульттеста Hexagon OBTI, определяемых в копрофильтратах, и их комбинаций при диагностике и скрининге рака толстого кишечника.
Материал и методы
Материалом исследования послужили образцы кала, взятые до начала лечения у 63 больных колоректальным раком с гистологически верифицированной аденокарциномой для определения информативности тестов, которые в дальнейшем планировалось использовать при скрининге. Контрольная группа представлена 20 здоровыми добровольцами из числа сотрудников ГАУЗ «РКОД МЗ РТ» и родственников исследователей, прошедших диспансеризацию.
Средний возраст больных ― 64,7±1,1 лет. У 18 больных была I стадия заболевания, у 22 ― II, у 19 ― III, у 4 больных ― IV стадия. Здоровые добровольцы в возрасте от 18 до 64 лет [4]. Основная группа и группа контроля сравнимы по возрасту (р=0,08) и полу.
Скрининг на базе ГАУЗ «РКОД МЗ РТ» и ООО «Поликлиника профилактической медицины» в 2010 году прошли 1071 человек. К скринингу допускались лица от 45 лет, исключались ― с кровотечением [3]. Средний возраст 59,6±1,1 лет.
Материалом исследования TIMP-1 при скрининге послужили образцы кала 73 обследуемых из 1071 с положительным Hexagon OBTI-тестом. Хронические заболевания прямой кишки выявлены у 39 человек, доброкачественные опухоли ― у 11, рак прямой кишки ― у 3, рак ободочной кишки ― у 1, патология не обнаружена ― у 21 [3].
Образцы кала собирали в пластиковую посуду, тщательно закрывали и хранили при -20°С до постановки анализа до 20 дней. Их размораживали не более одного раза для исследования уровня ферментов. В качестве диагностических тестов у больных колоректальным раком использовались MMP-9, TIMP-1, fTu M2-PK, Hexagon OBTI, в качестве скрининговых ― Hexagon OBTI, TIMP-1 и их комбинация.
Методика определения MMP-9, TIMP-1, fTu M2-PK и скрытой крови в кале Hexagon OBTI. Навеску свежего или замороженного кала, равную 1,0 грамму, разводили в 9,0 мл 0,9% раствора хлористого натрия (Т +2-+40С), тщательно перемешивали и центрифугировали при 3000 об./мин. в течение 15 минут при охлаждении. Центрифугат отбирали и использовали для анализа. При необходимости образцы копрофильтратов хранили в рефрижераторе в течение 7 дней при – 200С. Уровень ММР-9 и TIMP-1 в копрофильтратах определяли методом ИФА с помощью наборов Quantikine ELISA (R&D Systems, USA) согласно инструкции по применению, с нашей модификацией. Суть модификации состояла в том, что на первом этапе инкубирование образцов копрофильтратов в лунках планшета мы проводили не при комнатной температуре, а при +40С, поскольку в кале содержится большое количество микробных протеиназ, способных расщеплять белки, в том числе и ММР, и TIMP-1. Дальнейшие процедуры проводили согласно инструкции. Расчет уровня ММР-9 и TIMP-1 производили в нг по калибровочным кривым относительно стандарта. Окончательный пересчет делали на 1 г кала. Для определения уровня fTu M2-PK использовалась иммуноферментная тест-система ScheBo Tu M2-PKTM ELISA Stool Test (ScheBo Biotech AG, Германия) с моноклональными антителами, специфическими к димерной форме. Результаты выражали в Ед/г кала. За дискриминационный уровень были приняты средние значения тестов + 2õ. Для MMP-9 дискриминационный уровень составил 18,22 Ед/г кала, для TIMP-1 ― 1,2 Ед/г кала, fTu M2-PK ― 4,16 ЕД/г кала. Скрытую кровь в кале определяли экспресс-анализом Hexagon OBTI (HUMAN, Германия). При проявлении двух полосок результат считался положительным. Наиболее информативные тесты при диагностике рака толстого кишечника (Hexagon OBTI и TIMP-1) использовались при скрининге данной патологии [4]. Исследование кала на перечисленные выше маркеры проводилось в рамках рутинного клинического обследования пациентов на скрытую кровь в кале.
Статистический анализ был проведен с использованием программ Exсel 8 и Biostatistica [4]. Сравнение показателей групп пациентов и здоровых проводилось с помощью критерия Стьюдента. Отличия считались статистически значимыми при р<0,05. Данные представлены в виде M±m, где M ― среднее арифметическое значение, m ― ошибка средней.
Результаты исследования и их обсуждение
В группе больных колоректальным раком уровни MMP-9 и TIMP-1 в копрофильтратах (60,1±15,4 ед/г, 27,9±6,7 ед/г) были выше по сравнению с таковыми в группе здоровых (3,9±1,6 ед/г, 0,3±0,1 ед/г) (р=0,027 и р=0,016). У больных колоректальным раком уровень MMP-9 в копрофильтратах при 1-й стадии составил 34,9±13,0 ед/г, при 2-й ― 49,4±18,0 ед/г, при 3-й ― 50,6±27,8 ед/г, при 4-й стадии ― 70,4±64,9 ед/г. У больных уровень MMP-9 не зависел от стадии заболевания (p>0,05). Уровень TIMP-1 в копрофильтратах больных колоректальным раком при 1-й стадии составил 20,5±10,4 ед/г, при 2-й ― 11,77±99,3 ед/г, при 3-й ― 30,6±14,0 ед/г, при 4-й стадии ― 30,0±25,0 ед/г. У больных уровень TIMP-1 также не зависел от стадии заболевания (p>0,05).
Уровень MMP-9 (58,9±18,6 ед/г) и уровень TIMP-1 (27,9±8,2 ед/г) у больных раком прямой кишки достоверно не отличались (р>0,05) от таковых у больных раком ободочной кишки (37,0±13,3 ед/г и 28,0±12,7 ед/г) [14].
Значение fTu M2-PK в копрофильтратах больных колоректальным раком составило 1,66±0,38 ед/г, здоровых ― 0,84±0,38 ед/г, разница оказалась недостоверной (р=0,293) [14].
Гемокульттест Hexagon OBTI у 54 (85,7%) пациентов с колоректальным раком был положительным, у 9 (14,3%) человек ― отрицательным [14].
Информативность молекулярных маркеров в диагностике колоректального рака была следующей. Чувствительность: гемокульттеста Hexagon OBTI ― 86,2%, TIMP-1 ― 76,2%, MMP-9 ― 55,6%, fTu M2-PK ― 36,2%. Специфичность: гемокульттеста Hexagon OBTI ― 93,8%, TIMP-1 ― 95%, MMP-9 ― 100%, fTu M2-PK ― 66,6%. Точность: гемокульттеста Hexagon OBTI ― 87,7%, TIMP-1 ― 80,7%, MMP-9 ― 66,3%, fTu M2-PK ― 42,5%. Таким образом, TIMP-1 и Hexagon OBTI являются наиболее информативными тестами при диагностике рака толстого кишечника.
Учитывая высокую информативность TIMP-1 и Hexagon OBTI в диагностике рака толстого кишечника, эти маркеры были применены при скрининге данной патологии [14], причем, TIMP-1, учитывая его дороговизну, применяли у обследуемых лиц (73 человека) с положительным Hexagon OBTI-тестом. Максимальный уровень TIMP-1 выявлен при раке прямой кишки и тубулярной аденоме; он достоверно отличался от такового при других заболеваниях толстой кишки и от уровня в группе контроля (р<0,05) [3]. При скрининге рака толстого кишечника гемокульттест Hexagon OBTI был положительным во всех трех случаях рака прямой кишки и ложно отрицательным при раке ободочной кишки. Чувствительность при раке толстого кишечника ― 75%. Ложноположительный результат был у 22 (2,05%) человек: у 17 человек ― с геморроем, у 1 ― с ворсинчатым полипом прямой кишки и у 4 здоровых лиц. Информативность теста Hexagon OBTI при скрининге: чувствительность ― 75%, специфичность ― 97,9%, точность ― 97,9% [3]. Информативность при скрининге колоректального рака TIMP-1 оказалась следующей: чувствительность ― 100%, специфичность ― 70,8%, точность ― 76%. При комплексном применении Hexagon OBTI и TIMP-1 информативность возросла и составила: чувствительность ― 100%, специфичность ― 97,3%, точность ― 97,3%, т.е. комбинация двух тестов при скрининге колоректального рака показала большую информативность.
Ложноположительными оба маркера были у одного пациента с тубулярной аденомой и у одного с ворсинчатым полипом (данные заболевания ― облигатные предраки, требующие оперативного лечения) [3].
В немногочисленных исследованиях MMP-9 и TIMP-1 у больных колоректальным раком определяли в опухоли, окружающей опухоль здоровой ткани, плазме крови и использовали как прогностические тесты течения колоректального рака [7] или как фактор прогностического ответа опухоли на лучевую терапию [15].
Нами впервые был применен TIMP-1 в копрофильтратах больных колоректальным раком и использован как неинвазивный маркер при скрининге данной патологии. Уровень маркера у больных был достоверно выше уровня у здоровых. Чувствительность TIMP-1 при скрининге колоректального рака составила 100% [3].
Гемокульттест Hexagon OBTI показал высокую специфичность (97,9%) и точность (97,9%). Недостатком данного теста является низкая чувствительность, равная 75% [3].
Информативность применения гемокульттеста Hexagon OBTI в комбинации с TIMP-1 возрастает, что делает актуальным их совместное применение при скрининге колоректального рака в качестве неинвазивных тестов [3].
Выводы
- Маркеры MMP-9 и fTu M2-PK оказались малоинформативными при диагностике рака толстого кишечника.
- Гемокульттест Hexagon OBTI и TIMP-1 проявили себя как наиболее информативные тесты с чувствительностью, специфичностью и точностью 76,2%, 95%, 80,7% и 86,2%, 93,8%, 87,7% соответственно при диагностике рака толстого кишечника.
- Комплексное применение молекулярного маркера TIMP-1 и гемокульттеста Hexagon OBTI повысило информативность данных тестов при скрининге рака толстого кишечника: чувствительность ― 100%, специфичность ― 97,3%, точность ― 97,3%.
Таким образом, проведенный сравнительный анализ результатов собственных исследований по применению маркеров в диагностике и скрининге рака толстой кишки, которые ранее были представлены в двух наших статьях [3, 4], выявил, что наиболее информативными являются молекулярный маркер TIMP-1 и гемокульттест Hexagon OBTI, и их информативность при скрининге колоректального рака возрастает при их совместном применении.
Авторы статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, финансовой поддержки.
Литература
- Каприн А.Д., Старинский В.В., Петрова Г.В. (ред). Злокачественные новообразования в России в 2017 году (заболеваемость и смертность). ― М.: МНИОИ им. П.А. Герцена ― филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, 2018. ― 250 с. [
- Каприн А.Д., Старинский В.В., Петрова Г.В. (ред). Состояние онкологической помощи населению в России в 2018 году. ― М.: МНИОИ им. П.А. Герцена ― филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, 2019. ― 236 с.
- Старостина М.А., Афанасьева З.А. Информативность комплексного применения TIMP-1 и гемокульттеста Hexagon OBTI при скрининге колоректального рака // Практическая медицина. ― 2013. ― №2 (67). ― С. 146-9.
- Старостина М.А., Афанасьева З.А., Зинкевич О.Д. Информативность методов скрининга у больных раком толстого кишечника // Казанский медицинский журнал. ― 2011. ― 92 (1). ― С. 20-1.
- Romain Villéger, Amélie Lopès, Julie Veziant. Microbial markers in colorectal cancer detection and/or prognosis // World J. Gastroenterol. ― 2018. ― 24 (22). ― P. 2327-47. Available from: http://dx.doi.org/10.3748/wjg.v24.i22.2327
- Duffy M.J., van Rossum L.G.M., van Turenhout S.T. Use of faecal markers in screening for colorectal neoplasia: a European group on tumour markers position paper // Int. J. Cancer. ― 2011. ― 128. ― P. 3-11. Available from: https://doi.org/10.1002/ijc.25654.
- Кушлинский Н.Е., Герштейн Е.С. Исследование матриксных металлопротеиназ и тканевых ингибиторов в опухолях и периферической крови онкологических больных. Клинические перспективы // Лабораторная служба. ― 2013. ― №1. ― C. 25-38.
- Огнерубов Н.А., Милованов В.В., Иванников А.А., Ежова Е.Н. Исследование уровня фекальной пируваткиназы типа М2 при некоторых злокачественных новообразованиях // Вестник ТГУ. ― 2013. ― 18 (5-3). ― C. 2864-6.
- Tonus C., Sellinger M., Koss K., Neupert G. Faecal pyruvate kinase isoenzyme type M2 for colorectal cancer screening: A meta-analysis // World J. Gastroenterol. ― 2012. ― 18 (30). ― P. 4004-11. Available from: https://dx.doi.org/10.3748/wjg.v18.i30.4004
- Pamudurthy V., Bissonnette M. and Konda V. Biomarkers in colorectal cancer screening // J. Gastrointest. Dig. Syst. ― 2016. ― 6. ― P. 389. Available from: https://dx.doi.org/10.4172/2161-069X.1000389
- Faivre J., Dancourt V., Denis B., et al. Comparison between a guaiac and three immunohemical faecal occult blood tests in screening for colorectal cancer // European journal of cancer. ― 2012. ― 48 (16). ― P. 2969-76. Available from: https://doi.org/10.1016/j.ejca.2012.04.007
- Binefa G., Rodríguez-Moranta F., Teule A., Medina-Hayas M. Colorectal cancer: From prevention to personalized medicin // World J. Gastroenterol. ― 2014. ― 20 (22). ― P. 6786-808. Available from: http://dx.doi.org/10.3748/wjg.v20.i22.6786
- Kim B.C., Joo J., Chang H.J., et al. A Predictive Model Combining Fecal Calgranulin B and Fecal Occult Blood Tests Can Improve the Diagnosis of Colorectal Cancer // PLOS ONE. ― 2014. ― 9 (9). ― e106182. Available from: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0106182
- Старостина М.А., Афанасьева З.А., Зинкевич О.Д. Металлопротеиназы MMP-9 и их тканевые ингибиторы TIMP-1 в копрофильтратах у больных раком толстой кишки // Российский онкологический журнал. ― 2011. ― 6. ― С. 38-9.
- Клишо Е.В., Кондакова И.В., Чойнзонов Е.Л., и др. Связь уровня матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов в сыворотке крови с эффективностью лучевой терапии больных плоскоклеточными карциномами головы и шеи // Медицинская радиология и радиационная безопасность. ― 2012. ― 6. ― С. 51-7.