Реферат. Одним из наиболее значимых событий в молекулярном патогенезе КРР является мутация в гене K-ras. Сведения о прогностической значимости мутации гена в опухоли противоречивы и остаются предметом для дискуссий.
Цель исследования ― изучить частоту мутации в гене K-ras у больных колоректальным раком в Республике Татарстан. Исследовать взаимосвязь мутации в гене K-ras с клинико-морфологическим показателям опухоли для выявления факторов, влияющих на течение и прогноз заболевания.
В исследование включено 120 пациентов с колоректальным раком, получивших комбинированное лечение в ГАУЗ «Республиканский клинический онкологический диспансер МЗ РТ».
Результаты исследования. Наличие мутации в гене K-ras при колоректальном раке чаще встречается у пациентов молодого возраста, женского пола, у представителей русской национальности. Опухоли имеющие мутации в гене K-ras чаще метастазируют в регионарные лимфатические узлы и дают отдаленные метастазы. Пациенты с мутацией в гене K-ras имеют более низкую годичную выживаемость.
Ключевые слова: колоректальный рак, ген K-ras.
© И.Г. Гатауллин, М.Г. Гордиев, Р.К. Шакиров, Б.И. Гатауллин, 2016
УДК 616.34-006.66
И.Г. Гатауллин1, М.Г. Гордиев2, Р.К. Шакиров2, Б.И. Гатауллин1
1ГБОУ ДПО «Казанская государственная медицинская академия» МЗ РФ, г. Казань
2ГАУЗ «Республиканский клинический онкологический диспансер» МЗ РТ, г. Казань
3Приволжский филиал ФГБНУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина», г. Казань
Гатауллин Ильгиз Габдуллович ― доктор медицинских наук, профессор кафедры онкологии, радиологии и паллиативной медицины ГБОУ ДПО «Казанская государственная медицинская академия» МЗ РФ
420029, г. Казань, Сибирский тракт, д. 29, тел. (843) 519-26-86, e-mail: ilgizg@list.ru
Колоректальный рак (КРР) является одной из главных проблем современной онкологии из-за высокой заболеваемости и значительной смертности в России и других развитых странах Америки, Европы и Азии. Ежегодно в мире регистрируют более 1 млн 200 тыс. больных раком ободочной и прямой кишки и 700 тыс. смертей от него.
Поздняя диагностика остается одной из основных причин высокой смертности при КРР. По данным международной статистики, больные раком толстой кишки во время первичной диагностики распределяются по стадиям следующим образом: I ― 15%, II ― 20-30%, III ― 30-40%, IV ― 20-25%. Таким образом, более чем у половины больных диагноз устанавливается при III-IV стадии заболевания.
Высокие показатели смертности от КРР связаны с неадекватным стадированием, планированием лечения без учета прогностических (влияющих на исход заболевания) и предиктивных (влияющих на чувствительность к терапевтическим агентам) факторов, что зачастую приводит к неправильному или неполному лечению этой столь непростой и неоднородной группы больных.
Непрекращающиеся исследования в области фундаментальной онкологии, появление новых подходов к диагностике и лечению больных колоректальным раком, а также опыт наблюдения за такими больными обусловливают выделение новых факторов прогноза в рамках даже одной и той же стадии заболевания.
Одной из важнейших соматических мутаций, которые обнаруживают в опухолях толстой кишки, является мутация в гене K-ras, обнаруживаемая в опухолях толстой кишки с частотой от 30 до 50%.
Мутации в гене K-ras относятся к наиболее частым генетическим изменениям, характерным для колоректального рака. Эти мутации встречаются почти исключительно в соматическом варианте, обладают значительным онкогенным потенциалом и возникают на ранних этапах канцерогенеза. Вследствие этого они могут использоваться как для скрининга и мониторинга заболевания, так и в качестве прогностических маркеров. Молекулярный патогенез КРР к настоящему моменту исследован достаточно хорошо, и в процессе его изучения были найдены многочисленные кандидатные маркеры, использование которых потенциально способно улучшить чувствительность и специфичность скрининга и мониторинга рака толстой и прямой кишки, а также послужить основой для индивидуализированного подхода к лекарственной терапии его распространенных стадий.
Одним из наиболее значимых событий в молекулярном патогенезе КРР является мутация в гене K-ras. Частота мутации гена K-ras в опухолях толстой кишки, по данным различных авторов встречается от 30 до 50% [3].
Проводятся исследования влияния пола, возраста пациента, клинико-морфологических данных опухоли на частоту мутации гена K-ras [2]. Установлено, что опухоли с наличием мутации в гене K-ras не отвечают на терапию ингибиторами рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) [4]. По данным А.В. Беляевой (2012), у больных с мутантным типом K-ras опухоли чаще встречались у женщин, локализовались преимущественно в дистальных отделах кишки, а частота обнаружения метастазов в лимфатические узлы была в два раза выше по сравнению с больными, имеющими так называемый «дикий» тип гена K-ras [1]. В то же время в работе G. Palomba et al. (2016), посвященной анализу 551 случая колоректального рака не было выявлено значимой корреляции между KRAS мутацией в опухоли и полом, возрастом, анатомическим расположением и стадией заболевания на момент постановки диагноза [5]. Сведения о прогностической значимости мутации гена в опухоли противоречивы и остаются предметом для дискуссий [1, 6]. Вероятно, этнические и географические особенности оказывают свое влияние на генез колоректального рака, чем и может объясняться подобное различие. Учитывая генетическую гетерогенность населения Республики Татарстан, представляется интересным выяснить клинические и морфологические особенности течения колоректального рака при наличии и отсутствии мутации в гене K-ras .
Цель исследования ― изучить частоту мутации в гене K-ras у больных колоректальным раком в Республике Татарстан. Исследовать взаимосвязь мутации в гене K-ras с клинико-морфологическим показателям опухоли.
Материал и методы
В исследование включено 120 пациентов колоректальным раком, получивших комбинированное лечение в ГАУЗ «Республиканский клинический онкологический диспансер МЗ РТ». В исследование включены больные от 34 до 84 лет, средний возраст составил 62,4±10,21 лет. Из них 32 больных раком ободочной кишки, 62 больных ― раком прямой кишки, 26 больных ― раком сигмовидной кишки и ректосигмоидного отдела.
Распределение больных по стадиям классификации TNM показало, что опухоли стадии Т2 были у 19,6%, Т3 ― у 23,6%, Т4 ― у 56,8% больных. Регионарные метастазы отсутствовали у 45,3% больных, N 1 диагностирован в 44,6%, а N 2 ― в 10,1% случаев.
Пациентам был проведен генетический анализ на наличие мутации в гене K-ras на материале, полученном в результате оперативного вмешательства. Материалом исследования служили образцы опухолевой ткани из первичной опухоли и/или отдаленных метастазов, залитые в парафиновые блоки. Выделение опухолевых клеток производили методом стереотактической диссекции под контролем световой микроскопии со срезов, содержавших более 40% опухолевых клеток. После проведения ПЦР для достижения необходимого числа копий ДНК осуществляли определение мутаций по отклонению кривых плавления.
Выделение ДНК из опухолевого материала проводили с помощью наборов «ДНК-ткань-Ф» (ТестГен, Димитровград) согласно инструкции компании-производителя (для парафиновых блоков использовались 4 среза толщиной 10 мкм).
Стандартные плазмидные образцы, содержащие мутации, использовали в качестве положительного контроля. Искусственно синтезированные фрагменты ДНК размером 300 п.н., содержащие мутацию, вставляли в вектор pAL-TA. Плазмиды со вставкой были произведены ЗАО «Евроген» (г. Москва). Концентрацию определяли с помощью метода стандартных разведений, используя в качестве референса геномную ДНК Jurkat Genomic DNA (Thermo Fisher, США). Содержание мутантной ДНК варьировалось от 0 до 10%.
Для детекции мутаций в гене K-ras, использовали смеси праймеров и зондов в конечных концентрациях 900 и 600 нМ соответственно. Для ПЦР «в реальном времени» использовали термоциклер «Rotor-Gene 6000» (Qiagen, Германия), ПЦР-смесь готовили в 20 мкл реакционной смеси следующего состава: 70 мМ Трис-HCl, pH 8.8, 16.6 мМ сульфат аммония, 0.01%-ный Твин-20, 2 мМ хлорид магния, 200 нМ каждого dNTP, 500 нМ праймеров, 250 нМ флуоресцентных зондов, 1.5 ед. Taq ДНК-полимеразы. Условия амплификации фрагментов ДНК: 95C/2 мин ― 1-й цикл; 94C/10 сек, 62C/60 ― 60 циклов.
Комплекты олигонуклеотидов были разработаны и произведены ООО «Тестген» (г. Димитровград).
Список определяемых мутаций в генах KRAS, представлен в таблице.
Таблица. Мутации, определяемые в гене K-ras
|
В кодоне 12 |
В кодоне 13 |
|
Gly12Ser (GGT>AGT)
|
Gly13Asp (GGC>GAC) |
|
Gly12Arg (GGT>CGT)
|
|
|
Gly12Cys (GGT>TGT)
|
|
|
Gly12Asp (GGT>GAT)
|
|
|
Gly12Ala (GGT>GCT)
|
|
|
Gly12Val (GGT>GTT) |
|
Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета статистических программ на IBM-совместимом персональном компьютере с использованием приложений Microsoft Excel пакета Office XP Service Pack 2 и Statistica (StatSoft) версии 6.0. Для проведения сравнительного анализа полученных данных был применен критерий Стьюдента. Исследование показателей выживаемости проводили методом Каплана ― Майера.
Результаты собственных исследований
Из 120 пациентов у 35 выявлена мутация в гене K-ras, у 85 пациентов имелся «дикий» тип гена (частота мутаций составила 26,7%). Это несколько меньше, чем в целом по России, что, вероятно, связано с выраженной этнической гетерогенностью населения в данном регионе. Все мутации были обнаружены в первичной опухоли. Мутации гена K-ras в 12 кодоне наблюдали в 68% случаев, в 13 кодоне ― в 32% соответственно. Преимущественно в g12v(20%), g13d(33%), g12d(20%), g12s(7%), g12c(20%) кодонах.
У женщин частота мутаций в гене K-ras встречалась чаще ― в 37,7%, чем у мужчин ― 20,3%. Данные зависимости значимы (р=0,045).
В отличие от других исследований, мы отметили снижение частоты мутации в гене K-ras в более старших возрастных группах ― менее 10% в возрасте старше 60 лет и 56,3% в возрасте до 50 лет. Данная зависимость статистически значима (р=0,001).
Республика Татарстан имеет свои популяционные особенности. На ее территории проживают 2 титульные нации примерно в равной численности. На протяжении многих столетий совершались межнациональные браки. Тем не менее, результаты наших исследований показали, что у пациентов русской национальности мутации гена K-ras встречались несколько чаще ― в 39%,чем у татар ― 21% (р=0,045). У пациентов, имеющих регионарные метастазы, мутации гена K-ras встречались значительно чаще, ― 45,8%, чем при их отсутствии ― 4,9%. Данная зависимость является статистически значимой (р=0,001). Проведенное исследование показывает, что опухоли толстой кишки с мутантным типом гена K-ras более склонны к лимфогенному метастазированию, чем опухоли с «диким» типом, что косвенно свидетельствует о более агрессивном течении опухолевого процесса при мутации гена. При наличии отдаленных метастазов мутация гена K-ras была выявлена в трети наблюдений.
При сопоставлении частоты мутации гена K-ras в зависимости от локализации опухоли нами были выявлены следующие закономерности. У больных раком прямой кишки частота мутации составила 54,3%, раком сигмовидной кишки и рекосигмоидного отдела ― 25,7%, раком ободочной кишки ― 20%. Таким образом, чем дистальнее располагается опухоль, тем чаще в опухоли встречается мутантный тип гена K-ras.
Анализ прогностической значимости мутации гена K-ras показал, что среди 85 пациентов с «диким» типом гена K-ras в опухоли в течение года умерли 3 человека, годичная выживаемость составила 96,5%. Из 35 пациентов с «мутантным» типом гена K-ras в опухоли умерли 4 больных. Годичная выживаемость пациентов с мутантным типом составила 88,6%. Учитывая незначительное количество летальных исходов и небольшой срок наблюдения, данное различие в выживаемости пациентов статистически не достоверно (р>0,05). Однако набор материала продолжается, и в скором времени можно будет проводить расчет 3-х летней выживаемости, что даст нам более объективную картину. На наш взгляд, исследование на наличие мутации в гене K-ras у больных КРР и ее связь с клинико-морфологическими особенностями, течением и прогнозом заболевания является интересной и перспективной работой.
Заключение
Таким образом, наличие мутации в гене K-ras при колоректальном раке чаще встречается у пациентов молодого возраста, женского пола, у представителей русской национальности.
Опухоли, имеющие мутации в гене K-ras, чаще метастазируют в регионарные лимфатические узлы и дают отдаленные метастазы. Пациенты с мутацией в гене K-ras имеют более низкую годичную выживаемость.
Как показали наши исследования, мутация в гене K-ras является неблагоприятным признаком в отношении прогноза и течения КРР и может служить независимым значимым прогностическим признаком. Исходя из этого необходим персонифицированный подход к лечению больных КРР. Наличие мутации в гене K-ras является неблагоприятным фактором течения заболевания и должно учитываться при планировании комплексного лечения больных со второй стадией заболевания.
Литература
1. Беляева À.В., Моисеенко А.Б., Гуляев А.В. Современные представления о прогностических факторах колоректального рака // Вопросы онкологии. ― 2011. ― Т. 57, №3. ― С. 279-285.
2. Arber N., Shapira I., Ratan J. et al. Activation of c-K-ras mutations in human gastrointestinal tumors // Gastroenterology. ― 2000. ― 118. ― P. 1045-50.
3. Brink M. et al. K-ras oncogene mutations in sporadic colorectal cancer in The Netherlands Cohort Study // Carcinogenesis. ― 2003 Apr. ― 24 (4). ― P. 703-10.
4. Van Cutsem E. et al. KRAS status and efficacy in the first-line treatment of patients with metastatic colorectal cancer (mCRC) treated with FOLFIRI with or without cetuximab: The CRYSTAL experience // Journal of Clinical Oncology. ― ASCO Annual Meeting Proceedings (Post-Meeting Edition). ― 2008. ― Vol. 26, №15S (May 20 Supplement). ― 2.
5. Palomba G et al. Prognostic role of KRAS mutations in Sardinian patients with colorectalcarcinoma // Oncol. Lett. ― 2016 Aug. ― 12 (2). ― P. 1415-1421. Epub 2016 Jun 29.
6. Roth A.D. et al. Prognostic role of KRAS and BRAF in stage II and III resected colon cancer: results of the translational study on the PETACC-3, EORTC 40993, SAKK 60-00 trial // J. Clin. Oncol. ― 2010 Jan 20. ― 28 (3). ― P. 466-74.