Онкология ИДЕНТИФИКАЦИЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ОНКОМАРКЕРОВ С ПРИМЕНЕНИЕМ ИНВАЗИВНЫХ И НЕИНВАЗИВНЫХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
rus
ПОВОЛЖСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ВЕСТНИК

Научно-практический журнал для практикующих врачей и научных работников

Поиск

ИДЕНТИФИКАЦИЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ОНКОМАРКЕРОВ С ПРИМЕНЕНИЕМ ИНВАЗИВНЫХ И НЕИНВАЗИВНЫХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

© Е.Н. Телышева, 2014
УДК 616-006:575.17-078

 

Е.Н. Телышева

 

ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздрава России, г. Москва

 

 

Телышева Екатерина Николаевна — младший научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии и цитогенетики 117997, г. Москва, ул. Профсоюзная, д. 86, тел. +7-917-513-53-40, e-mail: Этот адрес электронной почты защищён от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра.

 

 

Реферат. Представлены результаты сравнительного анализа мутаций в гене B-Raf с использованием трех методов: прямое секвенирование по Сэнгеру; мутационно-специфическая ПЦР с детекцией в режиме «реального времени» и секвенирование следующего поколения (NGS). Были исследованы восемь пар образцов ДНК, выделенной из опухолевой ткани и плазмы крови пациентов со злокачественными и доброкачественными заболеваниями кожи. Полученные результаты позволили сделать вывод, что применение анализа свободно-циркулирующей ДНК в качестве неинвазивного метода исследования требует строгой стандартизации биологического материала и протокола его подготовки.
Ключевые слова: плазма крови, свободно-циркулирующая ДНК, неинвазивный метод, секвенирование следующего поколения (NGS).

 

 

Введение

 

Частота онкологических заболеваний во всем мире до сих пор остается высокой. В соответствии с данными ВОЗ, смертность от рака к 2030 году может возрасти на 45% из-за старения населения [1]. По этой причине усилия многих исследовательских групп направлены на поиски чувствительных и специфических биологических маркеров для ранней диагностики, прогноза и наблюдения за пациентами в процессе лечения различных онкологических заболеваний. 

Несмотря на то, что на сегодняшний день ДНК, выделенная из опухолевой ткани, является золотым стандартом для молекулярно-генетических исследований, существуют серьезные ограничения, связанные с ее применением. Очень часто биопсийный материал невозможно получить, или его получение связано с определенными трудностями и серьезными клиническими осложнениями для пациентов [2]. Операционный материал тоже не всегда пригоден для исследования, что может быть связано, например, с процессом приготовления гистологических препаратов. Важно также отметить, что одним из свойств опухолевой ткани является  гетерогенность, которая определяется различными молекулярно-генетическими профилями опухолевых клеток. Поэтому использование операционного или биопсийного материала далеко не всегда позволяет получить  полную  характеристику опухоли [3]. Учитывая также, что в процессе проведения дальнейшей терапии молекулярно-генетическая характеристика опухолевых клеток изменяется, важно прослеживать эти изменения для корректировки проводимой терапии. Получение биопсийного материала в динамике не всегда возможно.

Свободно-циркулирующие нуклеиновые кислоты (сцНК) в плазме и сыворотке крови, которые были открыты более трех десятилетий назад, вызывают большой интерес в качестве объекта для проведения молекулярно-генетических исследований. Были предприняты попытки выявить корреляцию между концентрацией внеклеточной ДНК и развитием ряда патологических состояний [4]. Показано, что количества сцДНК существенно возрастают у людей с некоторыми заболеваниями, и что сцДНК могут нести множество генетических и эпигенетических нарушений, отражающих процессы канцерогенеза. 

Анализ сцДНК и исследование возможного их применения для диагностики и мониторинга лечения проводят для довольно широкого диапазона заболеваний, в том числе для диабета, онкологических и аутоиммунных заболеваний. Первой опухоль-специ­фичный маркер, обнаруженный в крови онкологических больных, был мутированный Ras-ген. Большинство исследований, сконцентрированных на выявлении мутированного гена K-Ras в плазме или сыворотке крови, проводили на пациентах с диагнозом «колоректальный рак» и «рак поджелудочной железы», что связано с высокой частотой выявления мутаций K-Ras при данных патологиях [5]. 

Несмотря на рост исследований, связанных со сцДНК, на сегодняшний день некоторые важные аспекты биологии циркулирующих НК, такие как механизмы их высвобождения, способ циркуляции и биологическая роль в прогрессировании рака, до сих пор остаются неизвестными. Лимитирующими факторами в исследовании сцДНК в основном являются их низкая концентрация и  несовершенство методов анализа [1]. 

Цель работы — оценить возможность использования свободно-циркулирующей ДНК плазмы крови для анализа соматических мутаций при онкологических заболеваниях.

 

 

Материалы и методы исследования

 

На базе ФГБУ «РНЦ Рентгенорадиологии» Минздрава России обследовано семь пациентов с диагнозом «злокачественное заболевание кожи» (3 — с локальной болезнью, 4 — с региональными метастазами) и один пациент с диагнозом «доброкачественная патология кожи» (невус). Были собраны гистологические образцы операционного материала и образцы плазмы крови. Кровь забирали до операции (16 мл) в пробирки с ЭДТА перед хирургическим лечением. 

В течение часа после забора крови плазму отделяли от клеточного дебриса путем трехэтапного центрифугирования по 15 мин. при 4°С: при 1400 об/мин.; при 3400 об/мин.; при 4400 об/мин., соответственно. Аликвоты плазмы (по ~ 5 мл) хранили при температуре -80°С до проведения исследования. 

ДНК из гистологических образцов выделяли с помощью наборов DNA Clean&Concentrator-5 (Zymo Recearch). Свободно-циркулирующую ДНК выделяли из плазмы с помощью QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen), согласно инструкции производителя. 

Для исследования образцов ДНК на наличие мутаций в гене B-Raf применяли три метода анализа: прямое секвенирование по Сэнгеру (рис. 1); мутационно-специфическая ПЦР с детекцией в режиме «реального времени» («Евроген») (рис. 2) и секвенирование следующего поколения (NGS) с помощью наборов «CancerSnap», включающих 62 региона 17 генов (ООО «Номотек»). 

 

Результаты и обсуждение

 

Был проведен сравнительный анализ восьми пар образцов ДНК, выделенной из опухолевой ткани и плазмы крови. 

Мутации в гене B-Raf в ДНК опухолевой ткани определяли вышеуказанными тремя методами. В шести случаях были получены одинаковые результаты: при применении всех трех методов была выявлена мутация V600E. В двух случаях данная мутация была выявлена лишь двумя методами: ПЦР в режиме «реального времени» и NGS (табл. 1). Можно предположить, что причиной этого является небольшой процент опухолевых клеток с мутированным геномом, что связано с гетерогенностью опухоли. Также нельзя исключить и методические сложности, связанные с подготовкой исследуемого материала. Для проведения корректного исследования образец опухолевой ткани должен содержать не менее 60% опухолевых клеток.

Анализ мутаций в ДНК, выделенной из плазмы крови, проводили методом NGS с помощью наборов «CancerSnap», которые предназначены непосредственно для применения в клинической практике. Результаты проведенного исследования (первые данные, полученные с помощью панели «CancerSnap») показали, что только в одном из восьми образцов плазмы была выявлена мутация V600E в гене B-Raf. Следует особо остановиться на этом случае. У данного пациента была проведена операция по поводу удаления злокачественного образования кожи спины с метастазом в правый подмышечный лимфоузел. То есть анализ свободно-циркулирующей ДНК плазмы крови был проведен в момент  наибольшей опухолевой нагрузки. В остальных случаях мутации в гене B-Raf выявлены не были. Один пациент из обследованной группы был с доброкачественной патологией (№ 4149). Отсутствие мутации в ДНК плазмы крови в данном случае вполне объяснимо и не противоречит литературным данным [3]. Три случая (№№ 4328, 4354, 4701) — это пациенты с ранее удаленной первичной опухолью, кровь взята перед операцией по поводу удаления метастаза. Три пациента (№№ 3344, 4606, 4546) — с разной глубиной инвазии опухоли, но без регионарных и отдаленных метастазов. В качестве объяснения полученных данных можно преположить следующее. Одной из причин может быть гетерогенность опухоли — чем меньший процент опухолевой ДНК содержит мутацию, тем сложнее ее обнаружить в свободно-циркулирующей ДНК. Решить эту проблему можно двумя путями. Первый подход — увеличить выход свободно-циркулирующей ДНК в процессе выделения, что предполагает модификацию процесса получения и подготовки образцов плазмы и усовершенствование методов выделения ДНК. В настоящее время не существует единого стандарта для проведения таких исследований. Второй путь — внести изменения в процесс подготовки библиотек и процесс секвенирования для проведения более углубленного анализа, позволяющего выявлять изменения при минимальном количестве опухолевой ДНК в кровотоке. 

Для детектирования мутированной опухолевой ДНК среди большого количества ненарушенных молекул требуются высокочувствительные методы, и это является одной из причин, почему в различных исследованиях получаются весьма разнообразные и зачастую противоречивые результаты [1].   

На наш взгляд, одним из критических моментов является корректная подготовка плазмы крови для дальнейшего выделения свободно-циркулирующей ДНК, которая должна обязательно проводиться с учетом времени и условий забора крови. Планируемые дальнейшие исследования с включением в обследование новых пациентов с применением унифицированных методов подготовки биологического материала (и ткани, и крови) и методов выделения ДНК позволят пролить свет на многие неясные вопросы.

Таким образом, дальнейшие исследования должны быть направлены на валидацию и верификацию лабораторных методов и протоколов для молекулярно-генетических тестов при работе со свободно-циркулирующими НК плазмы крови перед их внедрением в клиническую практику. Должна быть оценена возможность применения  анализа циркулирующей опухолевой ДНК в различных клинических ситуациях, чтобы лучше понять ограничения и преимущества этого нового метода [2].

 

 

Выводы

 

На сегодняшний день показано, что многие генетические и эпигенетические изменения, которые присутствуют в опухолевых тканях, могут быть обнаружены в плазме онкологических больных. Однако проведенные нами исследования на ДНК, выделенной из опухолевой ткани и плазмы крови, позволяют сделать вывод, что применение неинвазивных методов для диагностики и мониторинга онкологических заболеваний требует строгой стандартизация как самого используемого биологического материала, так и протокола его подготовки для дальнейшего анализа. 

 

Работа выполнена при участии ООО «Евроген»

 

 

Литература

 

1. Gonzalez-Masia Jose A. Circulating nucleic acids in plasma and serum (CNAPS): applications in oncology / Jose A. Gonzalez-Masia, Damian Garcia-Olmo, Dolores C. Garcia-Olmo // OncoTargets and Therapy. — 2013. — № 6. — С. 819—820.

2. Diaz Luis A. Jr Liquid Biopsies: Genotyping Circulating Tumor DNA / Luis A. Diaz Jr, Alberto Bardelli // Journal of Clinical Oncology. — 2014. — № 6. — C. 581.

3. Murtaza M. Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA / Muhammed Murtaza, Sarah-Jane Dawson, Dana W.Y. Tsui et al. // Nature. — 2013. — № 497. — С. 108.

4. Тамкович С.Н. Циркулирующие ДНК крови и их использование в медицинской диагностике / С.Н. Тамкович, В.В. Власов, П.П. Лактионов // Молекулярная биология. — 2008. — № 1. — С. 18—19.

5. Chan K.C.A. and Lo Y.M.D. Circulating nucleic acids as a tumor marker // Histology and Histipatology. — 2002. — Vol. 17. — С. 938.



Наши партнеры



Copyright © 2015 | Все права защищены
WELCOME | ПОДДЕРЖКА