Онкология ЭФФЕКТИВНОСТЬ КОНЪЮГИРОВАННОЙ С ДНК ФОРМЫ ДОКСОРУБИЦИНА ПРИ КАРЦИНОМЕ РС-1 У КРЫС
rus
ПОВОЛЖСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ВЕСТНИК

Научно-практический журнал для практикующих врачей и научных работников

Поиск

ЭФФЕКТИВНОСТЬ КОНЪЮГИРОВАННОЙ С ДНК ФОРМЫ ДОКСОРУБИЦИНА ПРИ КАРЦИНОМЕ РС-1 У КРЫС

Н.А. Пятаев1, Г.Г. Мельцаев2, П.И. Скопин1, С.А. Щукин2, О.В. Минаева1, Е.Ю. Коровина1

УДК 616-006.6-085.277.3.033

 

1 ГОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева», Саранск

2 ГУЗ «Республиканский онкологический диспансер Республики Мордовия», Саранск

 

 

Реферат. Цель работы — изучить характер тканевого распределения доксорубицина при его введении в форме конъюгата с нативной ДНК и исследовать эффективность комплекса ДНК-доксорубицин у крыс с перевитой холангиоцеллюлярной карциномой РС-1. Выполнены эксперименты на крысах с перевитой холангиоцеллюлярной карциномой РС-1. Животные были разделены на 6 групп. В контрольной группе животные лечения не получали. В 1-й опытной группе вводили доксорубицин в дозе 1 мг/кг внутрибрюшинно, во 2-й, 3-й и 4-й опытных группах — конъюгат доксорубицина с ДНК (препарат деринат ЗАО «Техномедсервис», Россия) в дозах 1, 2 и 4 мг/кг соответственно, в 5-й опытной группе — только деринат. Исследовали характер тканевого распределения доксорубицина после инъекции и ряд показателей, характеризующих эффективность и токсичность химиотерапии: индекс массы опухоли; индекс торможения роста опухоли; летальность в процессе лечения; число лейкоцитов и тромбоцитов периферической крови, частоту токсической энтеропатии и миокардиодистрофии. Установлено, что введение доксорубицина в форме конъюгата с нативной ДНК изменяет характер распределения препарата. Регистрируется преимущественное накопление доксорубицина в тканях с высокой митотической активностью (опухолевой и лимфоидной ткани) на фоне снижения плазменной концентрации и концентрации в паренхиматозных органах. Показано, что конъюгированная с ДНК форма доксорубицина обладает несколько меньшей антибластомной активностью, но в эквивалентных по противоопухолевому эффекту дозах реже вызывает миокардиострофию и энтеропатию по сравнению с изолированным препаратом.

Ключевые слова: комплекс ДНК-доксорубицин, химиотерапия, кардиотоксичность, распределение, деринат.

 

 

Введение

 

Проблема избирательности противоопухолевой химиотерапии является одной из наиболее актуальных в современной онкофармакологии. Одним из принципиальных путей ее решения является направленный транспорт химиопрепаратов с помощью специфических векторов, обладающих тропностью к опухолевым клеткам. В качестве последних используются разнообразные химические соединения, каким-либо образом избирательно поглощающиеся опухолевыми клетками [1, 2, 3]. Наше внимание привлек препарат нативной ДНК — деринат (ЗАО «Техномедсервис», Россия). Главной особенностью метаболизма и кинетики препарата, позволяющей использовать его в качестве вектора для доставки химиопрепаратов к опухолевым клеткам, является выявленный факт избирательного накопления экзогенной ДНК в опухолевой ткани [4]. В исследованиях, проводимых с использованием меченного Н3-тимидином дерината, было установлено, что концентрация радионуклида в опухоли и лимфоузлах после внутрибрюшинного введения препарата была в 5—7 раз выше, чем в плазме и ткани паренхиматозных органов [3, 4]. Авторами данных работ высказывается мнение, что фрагменты молекулы ДНК, имеющие размер 50—120 нм, поглощаются клетками путем рецепторопосредованного эндоцитоза. Кроме того, в литературе имеются сведения о создании конъюгатов ряда противоопухолевых химиопрепаратов с ДНК in vitro [5—9]. В качестве таких препаратов были использованы доксорубицин и карминомицин. В работах Ю.П. Вайнберга и Д.Ю. Мельникова [5, 10] показано, что при экстракорпоральном взаимодействии дери-ната с доксорубицином и карминомицином в среде, содержащей альбумин, образуются устойчивые к диссоциации в водной среде комплексы, причем связь химиопрепаратов с молекулой ДНК носит некова-лентный характер. Данные исследования послужили основанием для разработки методики лечения рака молочной железы, желудка и толстого кишечника [11]. Однако следует отметить, что до настоящего времени не проводилось исследований кинетики и распределения, не установлена эффективная терапевтическая доза химиопрепаратов при их введении в форме конъюгатов с ДНК. Данные обстоятельства и послужили основанием для проведения настоящего исследования.

Цель работы — изучить характер тканевого распределения доксорубицина при его введении в форме конъюгата с нативной ДНК и исследовать эффективность комплекса ДНК-доксорубицин у крыс с перевитой холангиоцеллюлярной карциномой РС-1.

 

 

Материалы и методы

 

Выполнены эксперименты на 72 лабораторных крысах линии Vistar. Животным по достижении массы 80—100 г под кожу передней брюшной стенки перевивали штамм холангиоцеллюлярной карциномы РС-1. Животные были разделены на 6 групп, по 12 особей в каждой. В контрольной группе животные лечения не получали. В опытных группах на 7-й день после перевивки начинали лечение. В 1-й опытной группе вводили доксорубицин («Teva», Израиль) в дозе

1 мг/кг внутрибрюшинно; во 2, 3 и 4-й опытных группах — конъюгат доксорубицина с деринатом из расчета соответственно 1, 2 и 4 мг/кг конъюгированного доксорубицина, в 6-й — деринат (ЗАО «Техномедсер-вис», Россия) в дозе 7,5 мг/кг (доза, соответствующая дозе дерината во 2—4-й опытных группах). Инъекции производились 1 раз в 3 дня. На 21-е сут после начала лечения животных забивали. Забой производили через 30 мин после инъекции препаратов. В 1-й и 2-й опытных группах исследовали характер тканевого распределения доксорубицина.

Приготовление конъюгата дерината с доксоруби-цином осуществляли по методике Д.Ю. Мельникова [10] в собственной модификации. В стерильных условиях смешивали 2 мл водного раствора доксо-рубицина (12 мг/мл) и 1 мл 10% человеческого сывороточного альбумина. Инкубировали 30 мин при 4оС и непрерывном шейкировании, затем добавляли

2 мл 1,5% дерината, продолжали инкубацию в тех же условиях в течение 60 мин. Свободный доксорубицин удаляли диализом ацетатным буфером с рН 4,5. Для определения количества конъюгированного доксо-рубицина последний экстрагировали изопропанолом при 42оС в течение 60 мин, после чего раствор нагревали до 60оС, затем центрифугировали при 10000 g в течение 30 мин, надосадок отбирали и определяли в нем концентрацию препарата. Степень конъюгации доксорубицина составляла 60—170%.

В эксперименте определение концентрации док-сорубицина производили в плазме крови, опухолевой ткани, в тканях печени, почек, легких, в лимфоузлах, кишечной стенке и в мышечной ткани. Для исследований использовали высокоэффективную жидкостную хроматографию (хроматограф «Милихром 5-3», Россия), анализ выполняли по методике [12]. Параметры хроматографирования: детектор ультрафиолетовый, Л=254 нм, колонка КАХ-5, сорбент — нуклеосил С18, подвижная фаза — ацетонитрил + фосфатный буфер с рН 4,5 (v:v=70:30).

Во всех группах определяли показатели, характеризующие эффективность химиотерапии: индекс массы опухоли (отношение массы опухоли к массе тела животного); индекс торможения роста опухоли (ИТРО), рассчитываемый по формуле: ИТРО=(Мк — Мо)/Мк><100, где Мк и Мо — средняя масса опухоли соответственно в контрольной и опытных группах. Для оценки токсичности исследовали летальность в процессе лечения, определяли число лейкоцитов и тромбоцитов периферической крови, проводили морфологическое исследование желудка, кишечника, печени, почек, легких и миокарда.

Статистическую обработку данных осуществляли с использованием t-критерия Стьюдента и критерия Х-квадрат. Критический уровень значимости различий принимался равным 5% (р<0,05).

 

 

Результаты и их обсуждение

 

Тканевые концентрации определяли в 1-й и во 2-й опытных группах, где вводимые дозы доксорубицина были эквивалентны. Результаты определения представлены на рис. 1.

В 1-й опытной группе характер распределения препарата был относительно равномерным. В ткани опухоли концентрация препарата была равна (0,290±0,023) мкг/г, что составило 75% от плазменной концентрации. Наиболее высокие концентрации регистрировались в хорошо васкуляризованных тканях — в легких, печени, почках и миокарде [(0,572±0,051, 0,842±0,031 и 0,647±0,029) мкг/г соответственно]. Примечательно, что не было выявлено повышения концентрации доксорубицина в тканях с высокой митотической активностью клеток — лимфоузлах и селезенке. Концентрации исследуемой субстанции в этих тканях составила 0,421 мкг/г и 0,582 мкг/г соответственно.

Во 2-й опытной группе регистрировалось преимущественное накопление препарата в быстрорастущих и регенерирующих тканях, причем в большей степени — в лимфоидной и опухолевой ткани и в меньшей — в кишечной стенке. В опухоли концентрация превышала плазменную в 5,5 раза и достигала 0,959 мкг/г. В лимфоидной ткани содержание доксорубицина составляло (0,815±0,021) мкг/г, в ткани селезенки — (0,727±0,040) мкг/г. При этом плазменная концентрация и концентрация доксорубицина в паренхиматозных органах была в среднем в 2—2,5 раза ниже, чем в 1-й опытной группе. Разница концентраций в миокарде между 1-й и 2-й опытными группами составила почти 300% (0,594±0,021 и 0,188±0,011 соответственно).

Таким образом, полученные результаты позволяют заключить, что введение доксорубицина в виде конъюгата с ДНК меняет характер распределения препарата. Тканевое распределение препарата в данном случае практически полностью соответствует распределению меченых нуклеотидов, полученных Г.Г. Русиновой и соавт. [4] при введении экзогенной ДНК. Это свидетельствует о достаточно прочной связи доксорубицина с ДНК и отсутствии значимой диссоциации комплекса доксорубицин-ДНК до момента поглощения клетками. Учитывая, что условия экстракции вещества из тканей in vitro значительно отличаются от таковых in vivo, закономерно возникает вопрос, происходит ли расщепление комплекса доксорубицин-ДНК после поступления в клетку, и сохраняется ли антибластомная эффективность доксорубицина после конъюгации с ДНК? Этот вопрос стал предметом второй части нашего исследования, в которой была изучена антибластомная активность и токсичность доксорубицина и его конъюгатов с ДНК.

Результаты исследования антибластомной активности приведены в табл. 1.

Исследуемый штамм карциномы РС-1 проявил достаточную чувствительность к доксорубицину: в 1-й опытной группе («чистый» доксорубицин в дозе 1 мг/кг) индекс торможения роста опухоли составил 66,4%. Активность конъюгированной формы препарата была несколько меньшей и возрастала с увеличением дозы. Во 2-й опытной группе (конъю-гированный доксорубицин в дозе 1 мг/ кг) ИТРО был равен 30,4%, что на 54% меньше показателя 1-й опытной группы. Противоопухолевый эффект, эквивалентный эффекту «чистого» препарата, достигался при использовании дозы конъюгата 2 мг/кг (3-я опытная группа). ИТРО в данной группе был равен 69,2% и достоверно не отличался от такового в 1-й опытной группе. Конъюгированный доксо-рубицин в дозе 4 мг/кг (4-я опытная группа) имел максимально выраженный эффект (ИТРО=432%), который, однако, в 100% случаев сопровождался тяжелыми токсическими реакциями. Деринат в виде монотерапии (5-я опытная группа) не оказывал влияния на опухолевый рост. На рис. 2 приведены фотографии средних размеров опухолей для каждой из исследованных групп.

Анализ побочных и токсических эффектов химиотерапии показал, что встречаемость и выраженность осложнений при ее проведении различалась в сравниваемых группах (табл. 2).

При введении «чистого» доксорубицина у всех животных регистрировалась лейкопения [(9,4±0,8)х109/л против (18,9±1,6) х109/л в контроле, р<0,05], язвенные поражения кишечника встречались в 42% наблюдений, у 4 (33%) животных имелись морфологические признаки токсической миокардиодистрофии. Всего в процессе лечения пало 2 (16,7%) животных. Причиной их гибели стал язвенно-некротический энтероколит. Во 2-й опытной группе частота побочных эффектов химиотерапии была значительно меньшей. Летальных исходов в данной группе не регистрировалось, количество лейкоцитов в периферической крови достоверно не отличалось от такового в контроле, морфологических изменений со стороны внутренних органов не наблюдалось. В 3-й опытной группе отмечался 1 летальный исход, у выживших животных преобладали токсические эффекты со стороны кроветворной системы — лейкопения, тромбоцитопения и анемия, однако их выраженность была меньшей, чем при использовании «чистого» доксорубицина. Частота язвенного поражения кишечника и миокардиодистрофии составляла 16%, что почти в 2 раза меньше, чем в 1-й опытной группе. В 4-й опытной группе частота и выраженность токсических эффектов химиотерапии была наибольшей. Летальность в процессе терапии составила 58%. При вскрытии у 4 павших животных обнаружен язвенно-некротический энтероколит, у 3 — выраженные дистрофические изменения во всех внутренних органах (печени, почках, миокарде). У выживших отмечалась тяжелая миелосупрессия (число лейкоцитов — 2,7±0,1 х109/л, тромбоцитов — 40,4 х109/л), в 100% случаев обнаруживались язвы кишечника и регистрировались морфологические проявления гепатопатии и миокардиодистрофии.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что эффективные дозы доксорубицина при введении в виде конъюгата отличаются от таковых при использовании изолированной субстанции. Эквивалентная по противоопухолевой активности доза конъюгированного доксорубицина была примерно в 2 раза выше дозы чистого препарата. Наиболее вероятным объяснением данного факта является неполная диссоциация комплекса доксорубицин-ДНК в клетке. Вместе с тем конъюгированная форма доксорубицина в эффективной дозе вызывала достоверно меньше побочных эффектов. При этом токсичность препарата была пропорциональна степени накопления в тех или иных тканях. Так, у конъюгата, который слабо аккумулируется в миокарде и паренхиматозных органах, значительно уменьшались ульцерогенный и кардиотоксический эффекты. Степень миелосупрессии, особенно в отношении тромбоцитарного ростка, также была выражена в меньшей степени. Проведенные исследования продемонстрировали возможность повышения избирательности действия доксорубицина при введении в виде конъюгата с гетерологичной ДНК и показали перспективность проведения исследований в этом направлении.

 

Выводы

 

1. У крыс с перевитой карциномой РС-1 введение доксорубицина в форме конъюгата с нативной ДНК изменяет характер распределения препарата. Регистрируется преимущественное накопление доксору-бицина в тканях с высокой митотической активностью (опухолевой и лимфоидной ткани) на фоне снижения плазменной концентрации и концентрации в паренхиматозных органах.

2. Конъюгированная с ДНК форма доксорубици-на обладает меньшей антибластомной активностью по сравнению с изолированным препаратом, но оказывает меньшее токсическое воздействие на желудочно-кишечный тракт и миокард. Эквивалентная по противоопухолевой активности доза конъюги-рованного доксорубицина в два раза выше, чем доза «чистого» препарата.

 

 

Литература

 

1. Северин, е.С. Исследование эффективности различных белковых векторов в рецепторопосредованном транспорте биологически активных веществ в клетки / Е.С. Северин [и др.] // Информационный бюллетень РФФИ. — 1995. — Т. 3, № 4. — С.303.

2. Baurain, R. Plasma levels of doxorubicin after IV bolus injection and infusion of the doxorubicin-DNA complex in rabbits and man. Comparison with free doxorubicin / R. Baurain, D. Deprez-De Campeneere, A. Zenebergh, A. Trouet // Cancer Chemother Pharmacol. — 1982. — Vol. 9, № 2. — P.93—96.

3. Deprez-De Campeneere, D. Comparative study in mice of the toxicity, pharmacology, and therapeutic activity of daunorubicin-DNA and doxorubicin-DNA complexes / D. Deprez-De Campeneere, R. Baurain, M. Huybrechts, A. Trouet // Cancer Chemother Pharmacol. — 1979. — Vol. 2, № 1. — P.25—30.

4. Русинова, Г.Г. Особенности усвоения экзогенной ДНК и ее низкомолекулярных предшественников в организме животных / Г.Г. Русинова // Биохимия. — 1971. — Т. 36, № 5. — С.88—89.

5. Вайнберг, Ю.П. Физико-химические и биологические свойства комплекса ДНК с карминомицином / Ю.П. Вайн-берг // Медицина. — 1980. — № 9. — С.18—22.

6. Вайнберг, Ю.П. Активность лекарственных средств, полученных на основе нативной ДНК в отношении РНК- и ДНК-содержащих вирусов / Ю.П. Вайнберг, Д.Н. Носик, Э.Н. Каплина [и др.] // Медицина. — 1995. — № 6. — С.3—5.

7. Brown, I. The comparative toxicity and therapeutic efficacy of adriamycin and the adriamycin-DNA complex in the chemotherapy of C3H mice with transplanted mammary adenocarcinoma / I. Brown, H.W. Ward // Cancer Lett. — 1977. — Vol. 2, № 4—5. — P.227—232.

8. Hall, S.W. Doxorubicin-DNA complex: a phase I clinical trial / S.W. Hall, R.S. Benjamin, M.A. Burgess [et al.] // Cancer Treat. Rep. — 1982. — Vol. 66, № 12. — P.2033—2037.

9. Severin, S.E. Antitumor activity of conjugates of the oncofetal protein, alpha-fetoprotein and phthalocyanines in vitro / S.E. Severin [et al.] // Biochemistry and Molecular Biology International. — 1997. — Vol. 43, № 4. —P.873—881.

10. Мельников, Д.Ю. Применение иммуноконъюгатов в химиотерапии онкологических больных / Д.Ю. Мельников // Медицинская картотека. — 1999. — №7/8. — С.28—32.

11. Патент России № 20049721993, 1994.

12. European pharmacopoeia 5.0. — 2005. — P.1481—1482.



Наши партнеры



Copyright © 2015 | Все права защищены
WELCOME | ПОДДЕРЖКА