ЛАПАТИНИБ ПОТЕНЦИРУЕТ ЦИТОТОКСИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ДОКСОРУБИЦИНА В ОТНОШЕНИИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК С ФЕНОТИПОМ МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ IN VITRO

от
Print Friendly, PDF & EmailРаспечатать / Сохранить в PDF

© С.В. Бойчук, Т.В. Ивойлова, А.Р. Галембикова, 2024

УДК 615.277.3:616-006.04-08

 С.В. Бойчук1,2, Т.В. Ивойлова1, А.Р. Галембикова1

1ФГБОУ ВО «Казанский государственный медицинский университет» МЗ РФ, г. Казань

2ФГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования» МЗ РФ, г. Москва

 Бойчук Сергей Васильевич — член-корреспондент АН РТ, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой общей патологии, декан медико-биологического факультета ФГБОУ ВО «Казанский государственный медицинский университет» МЗ РФ

420012, г. Казань, ул. Бутлерова, д. 49, тел.: +7-917-397-80-93, (843) 236-72-63, e-mail: boichuksergei@mail.ru, SPIN-код: 8058-6246, Author ID: 130120, ORCID ID: 0000-0003-2415-1084

Реферат. Развитие резистентности злокачественных опухолей к химиопрепаратам (ХП) в настоящее время рассматривается в качестве одного из основных факторов неудовлетворительного прогноза у большинства пациентов с онкологическими заболеваниями, особенно их диссеминированными и рецидивирующими формами. Среди большого числа молекулярных механизмов вторичной резистентности опухолей к ХП особое внимание уделяется общебиологическим (т.е. универсальным) механизмам, в том числе, направленным на усиление экскреции лекарственных препаратов из опухолевых клеток за счет повышения в них активности АBC (от англ. ATP-binding cassette)-транспортеров. В результате проведенного исследования было показано, что некоторые ингибиторы тирозинкиназ (ИТ) способны усиливать действие ХП и вызывать ресенситизацию химиорезистентных опухолевых клеток различного происхождения (рак молочной железы, остеосаркома, и др.) к доксорубицину, паклитакселу и др. Среди всех исследованных ИТ наиболее эффективным оказался лапатиниб, который в комбинации с доксорубицином показал максимальные значения синергизма в отношении всех опухолевых клеточных линий. Этот эффект был обусловлен исключительно способностью лапатиниба нарушать экскрецию ХП из опухолевых клеток за счет ингибирования функции ABC-транспортеров, что, в конечном счете, индуцировало гибель опухолевых клеток по механизму апоптоза. Учитывая тот факт, что экскреция ХП доксорубицина и митоксантрона из клеток происходит за счет различных типов АВС-транспортеров (ABCB1 и ABCG2, соответственно), полученные данные свидетельствуют о способности лапатиниба ингибировать активность 2 основных типов ABC-транспортеров в опухолевых клетках. Таким образом, лапатиниб является эффективным ИТ, способным повышать чувствительность опухолевых клеток различного происхождения к ХП за счет нарушения их экскреции из опухолевых клеток, что создает предпосылки для углубленного изучения эффективности вышеописанных комбинаций противоопухолевых препаратов в доклиническом и клиническом аспектах.

Ключевые слова: лапатиниб, доксорубицин, множественная лекарственная устойчивость, АВС-транспортеры, ингибиторы рецепторных тирозинкиназ, синергизм, апоптоз.

Введение

Разработка и внедрение в клиническую онкологию низкомолекулярных ингибиторов тирозинкиназ (ИТ) имело революционные последствия в терапии многих злокачественных новообразований достоверно улучшив показатели общей и безрецидивной выживаемости онкологических больных. Это в полной мере относится к онкозаболеваниям, основным патогенетическим фактором которых является наличие в опухолевых клетках гиперэкспрессии и/или активирующих мутаций определенных генов тирозинкиназ, что приводит к активации в опухолевых клетках соответствующего сигнального пути, направленного на поддержание высокого пролиферативного потенциала опухолевых клеток и подавление процессов их гибели по механизму апоптоза. Например, таргетный препарат иматиниба мезилат (Гливек) показал свою высокую активность в терапии пациентов с хроническим миелолейкозом (ХМЛ) именно за счет наличия в опухолевых клетках слитного белка BCR-ABL, обладающего тирозинкиназной активностью и являющегося продуктом одноименного гена, возникшего в результате известной транслокации [1, 2]. Аналогичным образом, Гливек оказался чрезвычайно эффективным в отношении гастроинтестинальных стромальных опухолей (ГИСО) в силу наличия в них актививирующих мутаций KIT или PDGFRA [3, 4]. Наличие активирующей мутации BRAF V600 в клетках меланомы делает их чрезвычайно чувствительными к ингибитору вемурафенибу [5], мутации ALK в клетках немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) к кризотинибу [6], гиперэкспрессия Her2 в опухолевых клетках молочной железы к лапатинибу [7] и т.д.

Помимо высокой активности ИТ в отношении гиперактивированного в опухолевых клетках сигнального пути, в ходе исследований были также выявлены и иные их «способности», что в дальнейшем явилось предпосылкой для изучения возможности их комбинированного применения в сочетании с классическими химиопрепаратами (ХП), основной механизм действия которых основан на индукции повреждений ДНК в опухолевых клетках и их последующей гибели по механизму апоптоза вследствие несостоятельности процессов репарации данных повреждений. В частности, результаты некоторых исследований, в том числе, нашей научной группы, показали способность таргетных препаратов ингибировать процессы репарации повреждений ДНК (в частности, по механизму гомологичной рекомбинации), что приводило к повышению чувствительности опухолевых клеток к ХП отдельных групп [8-10].

Помимо ослабления процессов репарации повреждений ДНК в опухолевых клетках, другим перспективным подходом их сенситизации к ХП является воздействие на процессы их экскреции из опухолевых клеток, осуществляемые за счет работы АBC (от англ. ATP-binding cassette)-транспортеров. Данный механизм, обусловленный активацией преимущественно 3-х основных типов ABC-транспортеров (ABCB1, MRP-1 и ABCG2) в опухолевых клетках в настоящее время считается одним из основных механизмов вторичной резистентности злокачественных новообразований к подавляющему большинству химио- и таргетных препаратов [11-13], а поиск эффективных путей модуляции чувствительности злокачественных новообразований к ХП за счет угнетения активности вышеуказанных АВС-транспортеров рассматривается в качестве перспективного подхода для комбинированной терапии пациентов с онкологическими заболеваниями, прогрессирующими на фоне проводимой химиотерапии. В настоящее время известны 4 поколения лекарственных препаратов, а также соединений природного происхождения, обладающих способностью блокировать активность вышеуказанных белков в опухолевых клетках. К ингибиторам препаратам первого поколения относятся циклоспорин А, тамоксифен, верапамил, показавшие свою эффективность in vitro, но не показавшие аналогичных результатов in vivo из-за низкой аффинности к ингибируемым белкам и высокой токсичности, что сделало невозможным их применение в клинической практике [14]. Препараты второго поколения ― вальсподар, бирикодар ― проявляли высокую активность и специфичность по отношению к ABCB1, являясь при этом субстратом для других транспортеров (MRP-1 и ABCG2), что приводит к значительным фармакокинетическим изменениям, в том числе, при взаимодействии с другими ХП, и непредсказуемым побочным эффектам [15]. Ингибиторы третьего поколения тариквидар, элакридар и ланикидар, имеют гораздо более высокую аффинность к ABCB1 транспортеру, и их применение приводило к повышению чувствительности опухолевых клеток. Несмотря на это, результаты большинства клинических исследований не показали значительного улучшения основных клинических показателей (увеличение продолжительности безрецидивного периода и периода общей выживаемости) при применении комбинации препаратов третьего поколения и ХП. К ингибиторам 4-го поколения относятся препараты натурального происхождения, характеризующиеся обычно низкой токсичностью и хорошей переносимостью организмом человека. Например, флаваноиды, куркумин и его производные характеризуются лучшей пероральной доступностью и меньшей токсичностью по сравнению с препаратами предшествующих поколений [16]. Результаты исследований последних лет показали способность некоторых ИТ также могут эффективно ингибировать активность ABC-транспортеров, приводя, тем самым, к нарушению экскреции отдельных ХП из опухолевых клеток и повышая чувствительность к ним.

В связи с вышеизложенным, целью настоящего исследования явилось изучение способности некоторых ИТ в отношении химиорезистентных опухолевых клеточных линий различного происхождения, ранее полученных в нашей лаборатории.

 Материал и методы исследования

Исследования проводились на клеточных линиях мезенхимального (остеосаркома линии SaOS-2 и гастроинтестинальная стромальная опухоль линии GIST T-1) и эпителиального (тройной негативный рак молочной железы линии HCC1806) происхождения, в том числе с фенотипом множественной лекарственной устойчивости (МЛУ). Клеточные линии SaOS-2 и HCC1806 были получены из Американской коллекции клеточных культур (American Type Culture Collection (АТСС), США), клеточная линия GIST T-1 была получена из метастаза ГИСО желудка, имеющую гетерозиготную делецию из 57 пар оснований (V570-Y578) в 11-м экзоне KIT [17]. Сублинии с МЛУ были ранее получены в нашей лаборатории путем последовательного культивирования материнских опухолевых линий (SaOS-2, GIST T-1, HCC1806) с постепенно увеличивающимися концентрациями ХП: клеточная линия остеосаркомы, резистентная к доксорубицину (SaOS-2 Dox-R) [18]; клеточная линия гастроинтестинальной стромальной опухоли, резистентная к паклитакселу (GIST T-1 Tx-R) [19], а также клеточная линия тройного негативного рака молочной железы, резистентная к паклитакселу (HCC1806 Тх-R) [20]. Клеточные линии культивировали во влажной атмосфере с 5% содержанием CO2 при 37°C (LamSystems, Россия) в культуральной среде RPMI-1640 (ПАНЭКО, Россия), содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, США), 1% L-глутамина (ПАНЭКО, Россия), 50 Ед/мл пенициллина и 50 мкг/л стрептомицина (ПАНЭКО, Россия). Клетки культивировали в присутствии ХП ― доксорубицина, митоксантрона, паклитаксела, винбластина (Sigma, США) и ИТ ― иматиниба, сунитиниба, регорафениба, лапатиниба, PD173074, акситиниба, кабозантиниба и кризотиниба (Selleck Chem, США).

Для изучения цитотоксичности исследуемых ХП и характера взаимодействия между препаратами опухолевые клетки засевали в лунки плоскодонного 96-луночного культурального планшета (Сorning, США). После достижения 70-80%-ной конфлюентности клеток в культуру клеток вносили исследуемый препарат. Клетки культивировали с различными концентрациями препаратов в 3-х повторностях в течение 72 часов при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2. Пролиферативную способность опухолевых клеток определяли фотоколориметрически с помощью реагента CellTiter 96® AQueous MTS Reagent Powder (Promega, США) на планшетном анализаторе Multiscan FC (Thermo Scientific, США) при длине волны 492 нм. Половинную ингибирующую концентрацию (IC 50) исследуемых препаратов определяли с использованием электронного ресурса http://ic50.tk/ (по состоянию на 25.01.2024). Все данные нормализованы относительно контрольных клеток. Результаты были представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение для 3 биологических повторов. Степень комбинированных эффектов определяли количественно с помощью R-пакета вычислительного инструмента SynergyFinder (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/synergyfinder.html). Эталонная модель взаимодействия HSA (the Highest single agent) использовалась для расчета синергии. Средний показатель синергизма (average synergy score) использовался в качестве оценки взаимодействия комбинации препаратов. Показатель синергизма > 10 отражало синергию между двумя препаратами, а < -10, соответствовало антагонистическому взаимодействию между двумя препаратами. Промежуточные значения показателя синергизма (от 10 до -10) свидетельствовали об аддитивном эффекте исследуемых препаратов [21].

Для оценки уровня экспрессии белков использовали метод вестерн-блоттинга. С этой целью клетки трипсинизировали, дважды промывали ФСБ и лизировали на льду в течение 20 мин. с использованием буфера RIPA (25 мМ трис-HCl, pH 7,6, 150 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА, 1% NP-40, 1% дезоксихолат натрия и 0,1% SDS), дополненный ингибиторами протеазы и фосфатазы. Далее экстракты клеточных культур центрифугировали 30 мин. при 13000 об/мин. при 4°С. Осадок удаляли и определяли концентрацию белка в супернатанте (лизате цельных клеток) с помощью анализа Бредфорда. Образцы, содержащие 30 мкг белка, разделяли на гели NuPAGE от 4% до 12% Bis-Tris (Invitrogen, США), переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Bio-Rad, США), инкубировали со специфическим антителом и визуализировали с помощью усиленной хемилюминесценции (реагент Western Lightning Plus-ECL, США) на гель-документирующей системе «Fusion Solo WL.2M» (Vilber Lourmat, Франция). Для иммуноблотинга использовали следующие первичные антитела к расщепленным формам поли-(АДФ)-полимеразы (ПАРП) (#5625T) и каспазе-3 (#9661T), ABCB1 (#55510), MRP-1 (#18835), ABCG2 (#58222) (Santa Cruz Biotechnology, США) и бета-актину (A00730-200, Gene Script, США). Вторичные антитела, конъюгированные с HRP, были приобретены у Santa Cruz Biotechnology (США). Денситометрический анализ проводили в программе NIH Image J, версия 1.49 (Bethesda, США).

Экстракцию РНК из опухолевых клеток для количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР) с обратной транскрипцией проводили с помощью реагента TRIzol (Invitrogen, США) в соответствии с протоколом производителя. РНК обратно транскрибировали в комплементарную ДНК (кДНК) с использованием обратной транскриптазы вируса мышиного лейкоза Молони (ОАО «Евроген», Россия) в соответствии с протоколом производителя, а затем проводили кПЦР. Всего для кПЦР использовали 1 мкл матричной кДНК, содержащей 5x qPCRmix-HS SYBR (ЗАО «Евроген», Россия), а также прямые и обратные праймеры в концентрации 10 мМ (табл. 1). Последовательности праймеров и условия термоциклирования, используемые в этом исследовании, опубликованы в статье [20]. кПЦР проводили с использованием системы детекции в реальном времени CFX96 (Bio-Rad, США). Относительные уровни каждой матричной РНК нормализовали относительно GAPDH. Затем использовали метод 2-∆∆Cq для расчета относительной экспрессии генов [22]. Статистический анализ экспрессии генов был выполнен в программе GraphPad InStat, версия 3.05 (GraphPad Software, США) с применением непартного t-теста Стьюдента. Результаты считали статистически значимыми при p<0,05.

 Таблица 1. Праймеры для кПЦР в реальном времени

Table 1. Primers for quantitative polymerase chain reaction in real time

Ген Последовательность

прямых праймеров

 Последовательность

обратных праймеров
GAPDH GACCACAGTCCATGCCATCA TCCACCACCCTGTTGCTGTA
АВСВ1 ATGCTCTGGCCTTCTGGATGGGA ATGGCGATCCTCTGCTTCTGCCCAC
MRP-1 GCATGA TCCCTGAAGACGA TAGAGCTGGCCCTTGTACTC
MRP-2 TAGAGCTGGCCCTTGTACTC TCAACTTCCCAGACATCCTC
MRP-3 CGCCTGTTTTTCTGGTGGTT TCCCCCAGTCACAAAGATG
MRP-4 GCTGAGAATGACGCACAGAA TCCCAGCAAGGCACGATATT
MRP-5 GTCCTGGGTATAGAAGTGTG CAGAAGATCCACACAACCCT
MRP-7 CTCCCACTGGATCTCTCAGC TCGCATACACGGTGAGGTAG
ABCG2 TTTCCAAGCGTTCATTCAAAA A TACGACTGTGACAATGATCTGAGC

Для оценки интенсивности флуоресценции, опосредованной доксорубицином или митоксантроном, клетки предварительно инкубировали с лапатинибом (20 мкМ) в течение 120 мин. и далее подвергали воздействию 40 мкМ доксорубицина или 40 мкМ митоксантрона. Через 60 минут ХП тщательно смывали культуральной средой, не содержащей эмбриональной телячьей сыворотки, затем клетки дополнительно культивировали в течение 3 часов в присутствии лапатиниба (20 мкМ). Клетки анализировали с помощью проточного цитометра BD FACSCanto II (Becton Dickinson Biosciences, США) с использованием программного обеспечения BD FACSDiva, версия 7.0. Во всех группах сравнения для каждого образца было зарегистрировано не менее 10 000 событий. Результаты были представлены в виде среднего значения флюоресценции ± стандартное отклонение для 3 биологических повторов. Данные проточной цитометрии анализировали путем сравнения средних значений флюоресценции с использованием критерия Колмогорова ― Смирнова [23]. Результаты считали статистически значимыми при p<0,05.

 Результаты

Опухолевые клеточные сублинии Saos-2 Dox-R, GIST T-1 Tx-R, HCC1806 Tx-R имеют фенотип МЛУ, о чем свидетельствует развитие резистентности у данных сублиний к более чем одному стандартному ХП. Например, развитие устойчивости сублинии SaOS-2 Dox-R к доксорубицину (индекс резистентности (кратность изменений IC50 доксорубицина в резистентной сублинии SaOS-2 Dox-R по отношению к материнской линии SaOS-2) равен 6,1) сопровождалось развитием перекрестной устойчивости также к паклитакселу и винбластину (индекс резистентности равен 30,7 и 4,2, соответственно) (табл. 2). Развитие резистентности к паклитакселу у сублиний GIST T-1 Tx-R и HCC1806 Tx-R также сопровождалось кросс-резистентностью к доксорубицину, а в отношении HCC1806 Tx-R еще и к винбластину.

 Таблица 2. Значения IC50 (в мкМ) для доксорубицина, паклитаксела и винбластина в опухолевых линиях SaOS-2, SaOS-2 Dox-R, GIST T-1, GIST T-1 Tx-R, HCC1806, HCC1806 Tx-R (значения представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение) и индекс резистентности в сублиниях SaOS-2 Dox-R, GIST T-1 Tx-R и HCC1806 Tx-R; n=3

Table 2. IC50 values (in micro mols) for doxorubicin, paclitaxel and vinblastine in the tumor lines SaOS-2, SaOS-2 Dox-R, GIST T-1, GIST T-1 Tx-R, HCC1806, HCC1806 Tx-R (values are presented as an average value ± standard deviation) and resistance index in the sublines SaOS-2 Dox-R, GIST T-1 Tx-R and HCC1806 Tx-R; n=3

Клеточная линия Доксорубицин Паклитаксел Винбластин
SaOS-2 Dox-R 0,97±0,12 [18] 0,0000000039 ±

0,0000000008 [18]

 0,00029 ± 0,00005 [18]
SaOS-2 0,16±0,02 [18] 0,0000001196 ±

0,0000000209 [18]

 0,00122 ± 0,00021 [18]
Индекс резистентности SaOS-2 Dox-R 6,1 [18] 30,7 [18] 4,2 [18]
GIST T-1 Tx-R 6,5 ± 1 [24] 0,46 ± 0,08 [24] 0,073 ± 0,009
GIST T-1 0,04 ± 0,005 [24] < 0,01 [24] 0,044 ± 0,007
Индекс резистентности GIST T-1 Tx-R 162,5 [24] > 46 [24] 1,7
HCC1806 Tx-R 1,8 ± 0,5 [24] 5,4 ± 1 [24] 0,0003 ± 0,00004
HCC1806 0,22 ± 0,004 [24] 0,22 ± 0,01 [24] 0,25 ± 0,019
Индекс резистентности HCC1806 Tx-R 81,8 [24] 24,5 [24] 800

Молекулярным механизмом, обуславливающим фенотип МЛУ, у исследуемых сублиний является гиперэкспрессия ABC-транспортеров, регулирующих отток химиотерапевтических препаратов из опухолевых клеток. Сравнительный вестерн-блот анализ показал, что все исследуемые резистентные сублинии показали более чем 1,5 кратное повышение экспрессии АВСВ1, а также в случае сублинии SaOS-2 Dox-R еще и гиперэкспрессию другого АВС-транспортера ― MRР-1 (рис. 1).

Рис. 1. Уровень экспрессии белков МЛУ (АВСВ1, MRP-1, ABCG2) в клеточных линиях Saos-2, Saos-2 Dox-R, GIST T-1, GIST T-1 Tx-R, HCC1806, HCC1806 Tx-R. Бета-актин отражает белковую нагрузку в образце. Денситометрический анализ в программе NIH Image J (Bethesda, США) использовали для вычисления кратностей изменений уровней АВСВ1, MRP-1, ABCG2 по отношению к актину в клеточных линиях (Saos-2, Saos-2 Dox-R, GIST T-1, GIST T-1 Tx-R, HCC1806, HCC1806 Tx-R). Контрольный образец взят за 1

Fig. 1. Expression level of multidrug resistance proteins (АВСВ1, MRP-1, ABCG2) in the cell lines Saos-2, Saos-2 Dox-R, GIST T-1, GIST T-1 Tx-R, HCC1806, HCC1806 Tx-R. Beta-actin reflects the protein load in the sample. Densitometric analysis in the NIH Image J program (Bethesda, USA) was used to calculate the multiplicities of changes in the levels of АВСВ1, MRP-1, ABCG2 with respect to actin in cell lines (Saos-2, Saos-2 Dox-R, GIST T-1, GIST T-1 Tx-R, HCC1806, HCC1806 Tx-R). The control sample was taken for 1

Полученные результаты коррелировали с результатами, полученными с помощью ПЦР в реальном времени (табл. 3). Действительно, уровень мРНК АВСВ1 был многократно увеличен у резистентных сублиний SaOS-2 Dox-R, GIST T-1 Tx-R, HCC1806 Tx-R по сравнению с материнскими линиями SaOS-2, GIST T-1, HCC1806. В отношении сублинии SaOS-2 Dox-R также было показано достоверное увеличение экспрессии мРНК MRР-1, -4 и -7, а в отношении сублинии HCC1806 Tx-R ― MRР-2 и AВCG-2. 

Таблица 3. Кратность изменения экспрессии генов МЛУ у резистентных к ХП клеток (Saos-2 Dox-R, GIST T-1 Tx-R, HCC1806 Tx-R) по отношению к материнским клеткам (Saos-2, GIST T-1, HCC1806). Уровень значимости * ― 0.05<p<0.01, ** ― 0,01<p<0,001, *** ― p<0,001, n=3

Table 3. Multiplicity of changes in the expression of multidrug resistance genes in cells resistant to classical chemotherapy drugs (Saos-2 Dox-R, GIST T-1 Tx-R, HCC1806 Tx-R) in relation to maternal cells (Saos-2, GIST T-1, HCC1806). Significance level *― 0.05<p<0.01, ** ― 0.01<p<0.001, *** ― p<0.001, n=3

  Ген ABCB1 MRP-1 MRP-2 MRP-3 MRP-4 MRP-5 MRP-7 ABCG2
SaOS-2 Dox-R/ SaOS-2 Кратность изменений 20.2

[18]

 19.6 [18] 0.02 [18] 1.1 [18] 2.1 [18] 2.0 [18] 4.0 [18] 1.2

[18]
p **0.0082 *0.0165 0.2713 0.9030 *0.0422 – 0.0831 0.6241
GIST T-1 Tx-R/ GIST T-1 Кратность изменений 4.71 – – – 0.16 1.02 0.88 –
p **0.0043 – – – 0.2928 0.9751 0.7371 –
HCC1806 Tx-R/ HCC1806 Кратность изменений 4.79 – 3.96 0.32 1.00 0.49 2.42 6.28
p **0.0043 – **0.0049 0.0510 1.00 0.1874 0.0745 **0.0090

 Таблица 4. Уровень жизнеспособности опухолевых клеток сублиний Saos-2 Dox-R, GIST T-1 Tx-R, HCC1806 Tx-R под влиянием доксорубицина (0,5 мкМ), ИТ (иматиниб, сунитиниб, регорафениб, лапатиниб, PD173074, акситиниб, кабозантиниб и кризотиниб) (1 мкМ), а также комбинаций (ИТ + доксорубицин), культивированных в течение 48 часов. Значения представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение, n=3

Table 4. The viability level of tumor cells of sublines Saos-2 Dox-R, GIST T-1 Tx-R, HCC1806 Tx-R under the influence of doxorubicin (0.5 µm), tyrosine kinase inhibitors (imatinib, sunitinib, regorafenib, lapatinib, PD173074, axitinib, cabozantinib and crizotinib) (1 µm), and also combinations (IT + doxorubicin) cultured for 48 hours. The values are presented as an average value ± standard deviation, n=3

  SaОS-2 Dox-R GIST T-1 Tx-R HCC1806 Tx-R
Доксорубицин – + – + – +
– 100 ± 5 100 ± 6 100 ± 8 87 ± 3 100 ± 3 100 ± 1
Иматиниб 100 ± 2 100 ± 3 15 ± 1 14 ± 1 100 ± 2 100 ± 3
Сунитиниб 82 ± 5 78 ± 1 17 ± 3 15 ± 1 100 ± 3 90 ± 2
Регорафениб 71 ± 6 64 ± 2 17 ± 1 15 ± 1 100 ± 5 100 ± 1
Лапатиниб 100 ± 7 78 ± 2 100 ± 4 51 ± 4 100 ± 4 85 ± 2
PD173074 100 ± 1 100 ± 1 100 ± 2 72 ± 2 100 ± 1 100 ± 2
Акситиниб 100 ± 1 88 ± 4 14 ± 1 11 ± 1 100 ± 5 100 ± 2
Кабозантиниб 100 ± 2 87 ± 2 16 ± 1 10 ± 1 100 ± 1 100 ± 5
Кризотиниб 81 ± 6 72 ± 2 100 ± 1 42 ± 2 100 ± 1 90 ± 5

На следующем этапе настоящего исследования был проведен скрининг ИТ на их способность повышать чувствительность опухолевых клеток к ХП (в частности, к доксрубицину). Для этого опухолевые клетки инкубировали в присутствии доксорубицина (0,5 мкМ) и различных ИТ, таких как иматиниб, сунитиниб, регорафениб, лапатиниб, PD173074, акситиниб, кабозантиниб кризотиниб (1 мкМ), а также соответствующих комбинаций (ИТ + доксорубицин) в течение 48 часов. Затем проводили колориметрический МТS-тест, который позволил выявить уровень жизнеспособности опухолевых клеток сублиний Saos-2 Dox-R, GIST T-1 Tx-R, HCC1806 Tx-R под влиянием исследуемых препаратов в отдельности и в комбинации (табл. 4). Предварительные результаты скрининга позволили минимизировать круг потенциальных ИТ, способных ресенситизировать опухолевые клетки с фенотипом МЛУ к ХП. В частности, в отношении сублинии Saos-2 Dox-R таковыми были выбраны сунитиниб, регорафениб, лапатиниб, акситиниб, кабозантиниб и кризотиниб; для сублинии GIST T-1 Tx-R ― только лапатиниб, PD173074 и кризотиниб, так как остальные ИТ (иматиниб, сунитиниб, регорафениб, акситиниб, кабозантиниб) оказывали выраженное цитотоксическое действие на данные клетки вследствие присутствия в них специфических мишеней для данных таргетных препаратов ― с-Кit; для сублинии HCC1806 Tx-R ― сунитиниб, лапатиниб и кризотиниб.

Для выявления характера взаимодействия между доксорубицином и выбранными путем скрининга ИТ (синергизм, антагонизм, аддитивный эффект) были проведены серии колориметрических МТS-тестов с 5 концентрациями доксорубицина кратных 2 (0,125-2 мкM) и 4 концентрациями ИТ кратных 2 (0,5-4 мкM). С помощью программного обеспечения Synergy Finder были получены средние значения показателя синергизма для каждой сублинии, отраженные в таблице 5. Показатель синергизма > 10 был выявлен во всех сублиниях с фенотипом МЛУ только в отношении комбинации лапатиниб + доксорубицин, что свидетельствует о синергетическом взаимодействии между данными препаратами. Средний показатель синергизма для клеток Saos-2 Dox-R составил 18,0, для клеток GIST T-1 Tx-R ― 47,2, а для клеток HCC1806 Tx-R ― 23,5.

 Таблица 5. Показатели синергизма (HSА) между ИТ (сунитиниб, регорафениб, лапатиниб, PD173074, акситиниб, кабозантиниб, кризотиниб) и доксорубицином в клеточных линиях Saos-2 Dox-R, GIST T-1 Tx-R, HCC1806 Tx-R, рассчитанные в программе Synergy Finder

Table 5. Indicators of synergy (HSA) between tyrosine kinase inhibitors (sunitinib, regorafenib, lapatinib, PD173074, axitinib, cabozantinib, crizotinib) and doxorubicin in Saos-2 Dox-R, GIST T-1 Tx-R, HCC1806 Tx-R cell lines calculated in the Synergy Finder program

Клеточная линия SaOS-2 Dox-R GIST T-1 Tx-R HCC 1806 Tx-R
Сунитиниб + доксорубицин -0,12 – 7,2
Регорафениб + доксорубицин 8,3 – –
Лапатиниб + доксорубицин 18,0 47,2 23,5
PD173074 + доксорубицин – 12,4 –
Акситиниб + доксорубицин 3,2 – –
Кабозантиниб + доксорубицин 3,9 – –
Кризотиниб + доксорубицин 4,2 42,0 6,4

Также с помощью программного обеспечения Synergy Finder были получены двухмерный и трехмерный графики, отражающие оптимальные дозы доксорубицина и лапатиниба, которые обуславливают наибольший синергизм (рис. 2). Например, для клеток Saos-2 Dox-R наиболее выраженный цитотоксический эффект наблюдается при использовании доксорубицина в концентрации 1 мкМ и лапатиниба ― 4 мкМ, а для клеток GIST T-1 Tx-R и HCC1806 Tx-R ― 2 мкМ и 4 мкМ, соответственно.

Рис. 2. Синергизм доксорубицина и лапатиниба в клеточных линиях Saos-2 Dox-R (А), GIST T-1 Tx-R (Б), HCC1806 Tx-R (В). Для оценки синергизма доксорубицина с лапатинибом использовали программу Synergy Finder. Для определения оптимального синергизма был проведен колориметрический анализ цитотоксичности (МТS-тест) с 5 концентрациями доксорубицина кратных 2 (0,125-2 мкM) и 4 концентрациями лапатиниба кратных 2 (0,5-4 мкM)

Fig. 2. Synergism of doxorubicin and lapatinib in the cell lines Saos-2 Dox-R (A), GIST T-1 Tx-R (B), HCC1806 Tx-R (C). The Synergy Finder program was used to evaluate the synergy of doxorubicin with lapatinib. To determine the optimal synergy, a colorimetric cytotoxicity analysis (MTS test) was performed with 5 concentrations of doxorubicin multiples of 2 (0.125-2 micro mols) and 4 concentrations of lapatinib multiples of 2 (0.5-4 micro mols)

Действительно, инкубация опухолевых сублиний с фенотипом МЛУ в выбранных концентрациях доксорубицина и лапатиниба приводила к усиленной гибели опухолевых клеток. Результаты микроскопии показали, что культивирование опухолевых клеток в присутствии комбинации данных препаратов в течение 48 часов приводит к резкому снижению конфлюентности клеточных культур и увеличению количества флотирующих (погибающих) клеток по сравнению с контролем, а также клетками, инкубированными в присутствие только одного из вышеуказанных препаратов (рис. 3).

Рис. 3. Морфологические изменения в опухолевых клетках линий Saos-2 Dox-R (А), GIST T-1 Tx-R (Б), HCC1806 Tx-R (В), культивированных с ДМСO (контроль), лапатинибом (4 мкM), доксорубицином (2 мкM) и комбинации препаратов в течение 48 часов. Результаты световой микроскопии (увеличение 10х).

Fig. 3. Morphological changes in tumor cells of the Saos-2 Dox-R (A), GIST T-1 Tx-R (B), HCC1806 Tx-R (C) lines cultured with Dimethyl sulfoxide (control), lapatinib (4 micro mols), doxorubicin (2 micro mols) and drug combinations within 48 hours. The results of light microscopy (magnification 10x)

Гибель опухолевых клеток также была подтверждена методом вестерн-блоттинга, который показал повышенную экспрессию маркеров апоптотической гибели клеток ― расщепленных форм ПАРП и каспазы-3, во всех сублиниях с фенотипом МЛУ под влиянием комбинации лапатиниба и доксорубицина (рис. 4).

Рис. 4. Уровень экспрессии (вестерн-блоттинг) маркеров апоптоза (расщепленные формы ПАРП и каспазы-3) в клеточных линиях Saos-2 Dox-R, GIST T-1 Tx-R, HCC1806 Tx-R под влиянием ДМСО (контроль), лапатиниба (4 мкМ), доксорубицина (2 мкМ) и их комбинации, инкубированных в течение 48 часов. Бета-актин отражает белковую нагрузку в образце. Денситометрический анализ в программе NIH Image J (Bethesda, США) использовали для вычисления кратностей изменений уровней расщепленных форм ПАРП и каспазы-3 по отношению к актину в клеточных линиях (Saos-2 Dox-R, GIST T-1 Tx-R, HCC1806 Tx-R). Контрольный образец взят за 1

Fig. 4. The expression level (Western blotting) of apoptosis markers (split forms of PARP and caspase-3) in the cell lines Saos-2 Dox-R, GIST T-1 Tx-R, HCC1806 Tx-R under the influence of Dimethyl sulfoxide (control), lapatinib (4 micro mols), doxorubicin (2 micro mols) and their combinations incubated for 48 hours. Beta-actin reflects the protein load in the sample. Densitometric analysis in the NIH Image J program (Bethesda, USA) was used to calculate the multiplicities of changes in the levels of split forms of PARP and caspase-3 with respect to actin in cell lines (Saos-2 Dox-R, GIST T-1 Tx-R, HCC1806 Tx-R). The control sample was taken for 1

Для изучения способности лапатиниба нарушать экскрецию ХП из опухолевых клеток, был проведен анализ интенсивности флюоресценции ХП, обладающих автофлюоресценцией (доксорубицина или митоксантрона) в клеточной сублинии HCC1806 Tx-R, культивированной с данными ХП без (контроль) и в присутствии лапатиниба. Для этого клетки предварительно инкубировали в присутствии лапатиниба (20 мкМ) в течение 2 часов, а затем вносили флуоресцентный субстрат (например, доксорубицин (40 мкМ) или митоксантрон (40 мкМ)) на 1 час. После отмыва от флуоресцентного субстрата клетки инкубировали еще 3 часа в присутствии лапатиниба (20 мкМ). Было выявлено достоверное увеличение интенсивности доксорубицин-опосредованной флуоресценции в клетках HCC1806 Tx-R под влиянием лапатиниба (рис. 5А), что свидетельствует о способности данного ИТ ослаблять функцию ABC-транспортеров, экспрессия которых повышена в данных сублиниях с МЛУ (табл. 6). Аналогичные данные были получены при культивировании опухолевых клеток с митоксантроном в присутствии лапатиниба (рис. 5Б) (табл. 6).

Рис. 5. Интенсивность флюоресценции доксорубицина (A) и митоксантрона (Б) в клетках HCC1806 Tx-R, культивируемых в присутствии лапатиниба. Клетки предварительно инкубировали в присутствие лапатиниба (20 мкМ) в течение 2 часов, а затем вносили флуоресцентный субстрат (например, доксорубицин (40 мкМ) или митоксантрон (40 мкМ)) на 1 час. После отмыва от флуоресцентного субстрата клетки инкубировали еще 3 часа в присутствие лапатиниба (20 мкМ). Интенсивность флуоресценции измеряли методом проточной цитометрии. Гистограммы серого цвета отражают интенсивность автофлюоресценцию клеток, культивированных без каких-либо препаратов; красного цвета ― интенсивность флюоресценции доксорубицина (А) или митоксантрона (Б) в клетках, культивированных без лапатиниба (контроль); синего цвета ― клетки, культивированные в присутствии ХП в комбинации с лапатинибом. Сдвиг синих гистограмм вправо по сравнению с красными отражает повышение интенсивности флюоресценции ХП за счет снижения их экскреции из опухолевых клеток

Fig. 5. Fluorescence intensity of doxorubicin (A) and mitoxantrone (B) in HCC1806 Tx-R cells cultured in the presence of lapatinib. The cells were pre-incubated in the presence of lapatinib (20 micro mols) for 2 hours, and then a fluorescent substrate was introduced (for example, doxorubicin (40 micro mols) or mitoxantrone (40 micro mols)) for 1 hour. After washing from the fluorescent substrate, the cells were incubated for another 3 hours in the presence of lapatinib (20 micro mols). The fluorescence intensity was measured by flow cytometry. Gray histograms reflect the intensity of autofluorescence of cells cultured without any drugs; red ― the intensity of fluorescence of doxorubicin (A) or mitoxantrone (B) in cells cultured without lapatinib (control); blue ― cells cultured in the presence of CP in combination with lapatinib. The shift of the blue histograms to the right compared to the red ones reflects an increase in the fluorescence intensity of CP due to a decrease in their excretion from tumor cells

 Таблица 6. Средние значения флюоресценции доксорубицина и митоксантрона в клетках HCC1806 Tx-R, культивируемых в отдельности и в присутствии лапатиниба. Результаты были представлены в виде среднего значения флюоресценции ± стандартное отклонение для 3 биологических повторов. В скобках указаны процентные изменения значений флюоресценции в исследуемых группах относительно значений флюоресценции флюоресцентного субстрата, взятого за 100%. Уровень значимости * ― 0.05<p<0.01, ** ― 0,01<p<0,001, *** ― p<0,001

Table 6. Average fluorescence values of doxorubicin and mitoxantrone in HCC1806 Tx-R cells cultured separately and in the presence of lapatinib. The results were presented as an average fluorescence value ± standard deviation for 3 biological repeats. The percentage changes in fluorescence values in the studied groups relative to the fluorescence values of the fluorescent substrate taken as 100% are indicated in parentheses. Significance level * ― 0.05<p<0.01, ** ― 0.01<p<0.001, *** ― p<0.001

  Флуоресцентный субстрат Флюоресцентный субстрат + лапатиниб
Доксорубицин 5624 ± 62 (100%) 8637 ± 88 (154%)*
Митоксантрон 4889 ± 51 (100%) 37016 ± 455 (757%)***

Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют о том, что лапатиниб эффективно сенсибилизирует клетки с фенотипом МЛУ к доксорубицину за счет его способности аккумулировать ХП внутри опухолевых клеток и, тем самым, способствовать гибели последних по механизму апоптоза.

 Обсуждение

Известно, что подавление активности тирозинкиназ в опухолевых клетках в результате воздействия на них соответствующих ингибиторов обусловлено способностью последних связываться с АТФ-зависимым каталитическим доменом, что, в свою очередь, приводит к ингибированию активности соответствующих сигнальных путей в опухолевых клетках и влияет на процессы их пролиферации и жизнеспособности. В связи с этим, вполне логичным выглядит выдвинутое некоторыми исследователями предположение о способности ИТ связываться с соответствующими АТФ-зависимыми доменами ABC-транспортеров и оказывать аналогичный эффект в их отношении [15, 16, 25, 26]. Действительно, к настоящему времени накоплено достаточное количество экспериментальных данных, показывающих способность достаточно большого количества ИТ модулировать активность АВС-транспортеров в опухолевых клетках in vitro и повышать, тем самым, их чувствительность к действию ХП различных групп. Это было обнаружено в отношении иматиниба мезилата [27, 28], нилотиниба [29], сунитиниба [30], гефитиниба [31], эрлотиниба [32], лапатиниба [33], кабозатиниба [34], кризотиниба [35] и др. Способность некоторых ИТ вызывать сенситизацию опухолевых клеток по отношению к ХП была также показана в ряде доклинических исследований на ксенографтных моделях, в том числе, с использованием первичных опухолевых клеток [36-39]. Результаты исследования нашей группы показали, что ингибитор FGFR-сигнального пути инфигратиниб, используемый в настоящее время в терапии пациентов со злокачественными новообразованиями с гиперактивацией данного пути (например, холангиокарцинома), эффективно блокировал функциональную активность p-гликопротеина (ABCB1) и приводил к ресенситизации химиорезистентных опухолевых клеток различного происхождения (рак молочной железы, гастроинтестинальные стромальные опухоли и др.) к ингибитору ДНК-топоизомеразы II типа доксорубицину [24].

Результаты настоящего исследования показывают высокую активность лапатиниба, являющегося обратимым селективным ингибитором внутриклеточной тирозинкиназы, связывающимся с EGFR (рецептор эпидермального фактора роста, ErbB1) и HER2 (рецептор эпидермального фактора роста человека, ЕrbВ2) рецепторами, в отношении химиорезистентных опухолевых клеток различного происхождения (остеосаркома, рак молочной железы, гастроинтестинальные стромальные опухоли), полученных в экспериментальных условиях нашей лаборатории (см. выше). Действительно, результатом комбинированного воздействия лапатиниба и доксорубицина явилось значимое усиление гибели по механизму апоптоза у всех вышеперечисленных опухолевых клеточных линий (рис. 3 и 4) и чрезвычайно высокие показатели синергизма их действия (рис. 2). Обнаруженный нами эффект данного ИТ был обусловлен его способностью аккумулировать ХП внутри опухолевых клеток, что подтверждается результатами исследований с доксорубицином и митоксантроном, обладающих, как известно, автофлюоресцентными свойствами (рис. 5).

Несмотря на убедительно доказанную способность некоторых таргетных препаратов модулировать чувствительность опухолевых клеток к ХП различных групп in vitro, имеется ряд нерешенных вопросов, ограничивающих возможности их комбинированного применения. В частности, было показано, что некоторые ИТ сами могут являться субстратами для АBC-транспортеров и эффективно «откачиваться» из опухолевых клеток, и развитие событий по одному или другому сценарию (ингибирование функции ABC-транспортера или экскреция таргетного препарата ABC-транспортером) может зависеть от концентрации ИТ в опухолевой клетке. Например, была показана перекрестная резистентность к доксорубицину и сунитинибу в клетках эндотелия, гиперэкспрессирующих ABCB1 и ABCG2-транспортеры, а блокирование активности последнего существенным образом повышало чувствительность клеток к сунитинибу [40]. Комбинированное воздействие сунитиниба и элакридара (ингибитор ABCB1/ABCG2) на клетки почечно-клеточного рака с гиперэкспрессией ABCG2-транспортера повышало их чувствительность к сунитинибу [41], что также свидетельствует о том, что данный таргетный препарат является субстратом для ABC-транспортеров и может эффективно экскретироваться из опухолевых клеток с гиперфункцией одного из них. Другим фактором, способным оказывать негативный эффект комбинированного применения ИТ и ХП, может оказаться усиление системных побочных эффектов последнего (их), что является следствием их аккумуляции в здоровых тканях. В частности, в доклинических исследованиях на ксенографтных моделях опухолей было показано значительное усиление кардиотоксичности доксорубицина под действием нилотиниба [29].

Тем не менее, перспектива восстановления чувствительности злокачественных опухолей к ХП за счет преодоления их химиорезистентности в результате комбинированного применения ХП и ИТ, модулирующих активность АВС-транспортеров, по-прежнему остается крайне привлекательной, о чем свидетельствует большое количество проходящих в настоящее время клинических испытаний. Например, изучается эффективность комбинированного применения апатиниба (низкомолекулярный ИТ, избирательно блокирующий рецепторы сосудистого эндотелиального фактора роста 2-го типа) и этопозида у пациентов с серозным раком яичника, резистентного к цисплатину [42]. В то же время для пациентов с глиобластомами изучается возможность комбинированного использования данного ингибитора в комбинации с иринотеканом [43]. Проводятся исследования по изучению эффективности комбинированного применения низкомолекулярного мультикиназного ингибитора сорафениба и доксорубицина у пациентов c гепатоклеточной карциномой [44], а также использования данного таргетного препарата в комбинации с гемцитабином или цисплатином для пациентов с холангиокарциномой [45]. Многообещающие результаты были получены в результате комбинированного применения лапатиниба или нератиниба в сочетании с паклитакселом у пациентов с метастатической формой HER2-позитивного рака молочной железы [46, 47]. Улучшение клинических показателей было также достигнуто в результате комбинированного применения нинтеданиба (ингибитора VEGFR1-3, используемого в настоящее время для лечения специфической патогенетической терапии идиопатического легочного фиброза) и доцетаксела у пациентов с немелкоклеточным раком легкого [48], а также вышеуказанного ингибитора микротрубочек веретена деления, применяемого в комбинации с сунитинибом у пациентов с метастатическим раком желудка, резистентного к препаратам платины и др. [49].

Таким образом, изучение возможностей модуляции активности ABC-транспортеров в опухолевых клетках в результате «офф-таргетного» эффекта низкомолекулярных ИТ является одним из перспективных научных и клинических направлений, направленных на преодоление неизбежно возникающей лекарственной устойчивости злокачественных опухолей к современным ХП.

Заключение

В результате проведенного скрининга по изучению способности ИТ вызывать ресенситизацию резистентных к ХП опухолевых клеток наиболее эффективным оказался лапатиниб, о чем свидетельствуют максимальные значения синергизма между данным ИТ и доксорубицином. Это было обусловлено способностью лапатиниба нарушать экскрецию ХП из опухолевых клеток за счет ингибирования функции ABC-транспортеров, что, в конечном счете, индуцировало гибель опухолевых клеток по механизму апоптоза.

 Информация о конфликте интересов

Авторы заявляют об отсутствии возможных конфликтов интересов.

Исследования выполнены при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант №20-15-00001).

Авторы выражают благодарность Валеевой Е.В. за помощь в проведении ПЦР в реальном времени для оценки уровня экспрессии генов МЛУ.

Литература

  1. Druker B.J., Sawyers C.L., Kantarjian H., et al. Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome // N. Engl. J. Med. ― 2001. ― 344. ― Р. 1038-1042. doi: 10.1056/NEJM200104053441402
  2. Druker B.J., Talpaz M., Resta D.J., et al. Efficacy and safety of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in chronic myeloid leukemia // N. Engl. J. Med. – 2001. ― 344. ― Р. 1031-1037. doi: 10.1056/NEJM200104053441401
  3. Demetri G.D., von Mehren M., Blanke C.D., et al. Efficacy and safety of imatinib mesylate in advanced gastrointestinal stromal tumors // N. Engl. J. Med. ― 2002. ― 347. ― Р. 472-480. doi: 10.1056/NEJMoa020461
  4. Verweij J., Casali P.G., Zalcberg J., et al. Progression-free survival in gastrointestinal stromal tumors with high-dose imatinib: Randomized trial // Lancet. ― 2004. ― 364. ― Р. 1127-1132. doi: 10.1016/S0140-6736(04)17098-0
  5. Chapman P.B., Robert C., Larkin J., et al. Vemurafenib in patients with BRAFV600 mutation-positive metastatic melanoma: final overall survival results of the randomized BRIM-3 study // Ann. Oncol. ― 2017. ― 28 (10). ― Р. 2581-2587. doi: 10.1093/annonc/mdx339
  6. Shaw A.T., Kim D.W., Nakagawa K., et al. Crizotinib versus chemotherapy in advanced ALK-positive lung cancer // N. Engl. J. Med. ― 2013. ― 368 (25). ― Р. 2385-2394. doi: 10.1056/NEJMoa1214886
  7. Bilancia D., Rosati G., Dinota A., et al. Lapatinib in breast cancer // Ann. Oncol. ― 2007. ― 18 (6). ― Р. 26-30. doi: 10.1093/annonc/mdm220
  8. Бойчук С.В., Галембикова А.Р. Иингибитор АКТ-сигнального пути потенцирует цитотоксическую активность доксорубицина в отношении клеток остеосарком in vitro // Поволжский онкологический вестник. ― 2022. ― Т. 13, №3. ― С. 8-20. doi: 10.32000/2078-1466-2022-3-8-20
  9. Boichuk S., Bikinieva F., Nurgatina I., et al. Inhibition of AKT-Signaling Sensitizes Soft Tissue Sarcomas (STS) and Gastrointestinal Stromal Tumors (GIST) to Doxorubicin via Targeting of Homology-Mediated DNA Repair // International Journal of Molecular Sciences. ― 2020. ― 21 (22). ― Р. 8842. doi: 10.3390/ijms21228842
  10. Boichuk S., Dunaev P., Galembikova A., et al. Inhibition of FGFR2-Signaling Attenuates a Homology-Mediated DNA Repair in GIST and Sensitizes Them to DNA-Topoisomerase II Inhibitors // International Journal of Molecular Sciences. ― 2020. ― 21 (1). ― Р. 352. doi: 10.3390/ijms21010352
  11. Бойчук С.В., Ивойлова Т.В. Роль ABC-транспортеров в поддержании гомеостаза, патогенезе и терапии онкологических заболеваний // Успехи молекулярной онкологии. ― 2024. ― 1.
  12. Robey R.W., Pluchino K.M., Hall M.D., et al. Revisiting the role of ABC transporters in multidrug-resistant cancer // Nat. Rev. Cancer. ― 2018. ― 18 (7). ― Р. 452-464. doi: 10.1038/s41568-018-0005-8
  13. Alam A., Locher K.P. Structure and Mechanism of Human ABC Transporters // Annu. Rev. Biophys. ― 2023. ― 52. ― Р. 275-300. doi: 10.1146/annurev-biophys-111622-091232
  14. Juan-Carlos P.M., Perla-Lidia P.P., Stephanie-Talia M.M., et al. ABC transporter superfamily. An updated overview, relevance in cancer multidrug resistance and perspectives with personalized medicine // Mol. Biol. Rep. ― 2021. ― 48 (2). ― Р. 1883-1901. doi: 10.1007/s11033-021-06155-w
  15. Xiao H., Zheng Y., Ma L., et al. Clinically-Relevant ABC Transporter for Anti-Cancer Drug Resistance // Front. Pharmacol. ― 2021. ― 12. ― Р. 648407. doi: 10.3389/fphar.2021.648407
  16. M.F. Gonçalves B., S.P. Cardoso D., U. Ferreira M.J. Overcoming Multidrug Resistance: Flavonoid and Terpenoid Nitrogen-Containing Derivatives as ABC Transporter Modulators // Molecules. ― 2020. ― 25 (15). ― Р. 3364. doi: 10.3390/molecules25153364
  17. Taguchi T., Sonobe H., Toyonaga S., et al. Conventional and molecular cytogenetic characterization of a new human cell line, GIST-T1, established from gastrointestinal stromal tumor // Lab. Invest. ― 2002. ― 82 (5). ― Р. 663-665. doi: 10.1038/labinvest.3780461
  18. Boichuk S., Bikinieva F., Valeeva E., et al. Establishment and Characterization of Multi-Drug Resistant p53-Negative Osteosarcoma SaOS-2 Subline // Diagnostics (Basel). ― 2023. ― 13 (16). ― Р. 2646. doi: 10.3390/diagnostics13162646
  19. Хуснутдинов Р.Р., Галембикова А.Р., Бойчук С.В. Получение клона клеток гастроинтестинальной стромальной опухоли с признаками множественной лекарственной устойчивости и оценка его свойств // Соврем. технол. в мед. ― 2016. ― 8 (4). ― С. 36-41. doi: 10.17691/stm2016.8.4.05
  20. Boichuk S., Galembikova A., Sitenkov A., et al. Establishment and characterization of a triple negative basal-like breast cancer cell line with multi-drug resistance // Oncol. Lett. ― 2017. ― 14 (4). ― Р. 5039-5045. doi: 10.3892/ol.2017.6795
  21. Yadav B., Wennerberg K., Aittokallio T., et al. Searching for Drug Synergy in Complex Dose-Response Landscapes Using an Interaction Potency Model // Comput. Struct. Biotechnol. J. ― 2015. ― 13. ― Р. 504-513. doi: 10.1016/j.csbj.2015.09.001
  22. Kuang Y.H., Shen T., Chen X., et al. Lapatinib and erlotinib are potent reversal agents for MRP7 (ABCC10)-mediated multidrug resistance // Biochem. Pharmacol. ― 2010. ― 79 (2). ― Р. 154-161. doi: 10.1016/j.bcp.2009.08.021
  23. Young I.T. Proof without prejudice: use of the Kolmogorov-Smirnov test for the analysis of histograms from flow systems and other sources // J Histochem. Cytochem. ― 1977. ― 25 (7). ― Р. 935-941. doi: 10.1177/25.7.894009
  24. Boichuk S., Dunaev P., Mustafin I., et al. Infigratinib (BGJ 398), a Pan-FGFR Inhibitor, Targets P-Glycoprotein and Increases Chemotherapeutic-Induced Mortality of Multidrug-Resistant Tumor Cells // Biomedicines. ― 2022. ― 10 (3). ― Р. 601. doi: 10.3390/biomedicines10030601
  25. Shukla S., Chen Z.S., Ambudkar S.V. Tyrosine kinase inhibitors as modulators of ABC transporter-mediated drug resistance // Drug. Resist. Updat. ― 2012. ― 15 (1-2). ― Р. 70-80. doi: 10.1016/j.drup.2012.01.005
  26. Krchniakova M., Skoda J., Neradil J., et al. Repurposing Tyrosine Kinase Inhibitors to Overcome Multidrug Resistance in Cancer: A Focus on Transporters and Lysosomal Sequestration // Int. J. Mol. Sci. ― 2020. ― 21 (9). ― Р. 3157. doi: 10.3390/ijms21093157
  27. Burger H., van Tol H., Brok M., et al. Chronic imatinib mesylate exposure leads to reduced intracellular drug accumulation by induction of the ABCG2 (BCRP) and ABCB1 (MDR1) drug transport pumps // Cancer. Biol. Ther. ― 2005. ― 4 (7). ― Р. 747-752. doi: 10.4161/cbt.4.7.1826
  28. Jordanides N.E., Jorgensen H.G., Holyoake T.L., et al. Functional ABCG2 is overexpressed on primary CML CD34+ cells and is inhibited by imatinib mesylate // Blood. ― 2006. ― 108 (4). ― Р. 1370-1373. doi: 10.1182/blood-2006-02-003145
  29. Zhou Z.Y., Wan L.L., Yang Q.J., et al. Nilotinib reverses ABCB1/P-glycoprotein-mediated multidrug resistance but increases cardiotoxicity of doxorubicin in a MDR xenograft model // Toxicol. Lett. ― 2016. ― 259. ― Р. 124-132. doi: 10.1016/j.toxlet.2016.07.710
  30. Dai C.L., Liang Y.J., Wang Y.S., et al. Sensitization of ABCG2-overexpressing cells to conventional chemotherapeutic agent by sunitinib was associated with inhibiting the function of ABCG2 // Cancer Lett. ― 2009. ― 279 (1). ― Р. 74-83. doi: 10.1016/j.canlet.2009.01.027
  31. Kitazaki T., Oka M., Nakamura Y., et al. Gefitinib, an EGFR tyrosine kinase inhibitor, directly inhibits the function of P-glycoprotein in multidrug resistant cancer cells // Lung Cancer. ― 2005. ― 49 (3). ― Р. 337-343. doi: 10.1016/j.lungcan.2005.03.035
  32. Lainey E., Sébert M., Thépot S., et al. Erlotinib antagonizes ABC transporters in acute myeloid leukemia // Cell Cycle. ― 2012. ― 11 (21). ― Р. 4079-4092. doi: 10.4161/cc.22382
  33. Dai C.L., Tiwari A.K., Wu C.P., et al. Lapatinib (Tykerb, GW572016) reverses multidrug resistance in cancer cells by inhibiting the activity of ATP-binding cassette subfamily B member 1 and G member 2 // Cancer Res. ― 2008. ― 68 (19). ― Р. 7905-7914. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-08-0499
  34. Zhang G.N., Zhang Y.K., Wang Y.J., et al. Modulating the function of ATP-binding cassette subfamily G member 2 (ABCG2) with inhibitor cabozantinib // Pharmacol. Res. ― 2017. ― 119. ― Р. 89-98. doi: 10.1016/j.phrs.2017.01.024
  35. Zhou W.J., Zhang X., Cheng C., et al. Crizotinib (PF-02341066) reverses multidrug resistance in cancer cells by inhibiting the function of P-glycoprotein // Br. J. Pharmacol. ― 2012. ― 166 (5). ― Р. 1669-1683. doi: 10.1111/j.1476-5381.2012.01849.x
  36. Zhao X.Q., Xie J.D., Chen X.G., et al. Neratinib reverses ATP-binding cassette B1-mediated chemotherapeutic drug resistance in vitro, in vivo, and ex vivo // Mol. Pharmacol. ― 2012. ― 82 (1). ― Р. 47-58. doi: 10.1124/mol.111.076299
  37. Yang K., Chen Y., To K.K., et al. Alectinib (CH5424802) antagonizes ABCB1- and ABCG2-mediated multidrug resistance in vitro, in vivo and ex vivo // Exp. Mol. Med. ― 2017. ― 49 (3). ― Р. 303. doi: 10.1038/emm.2016.168
  38. Chen Z., Chen Y., Xu M., et al. Osimertinib (AZD9291) Enhanced the Efficacy of Chemotherapeutic Agents in ABCB1- and ABCG2-Overexpressing Cells In Vitro, In Vivo, and Ex Vivo // Mol. Cancer Ther. ― 2016. ― 15 (8). ― Р. 1845-1858. doi: 10.1158/1535-7163.MCT-15-0939
  39. Zhang H., Patel A., Ma S.L., et al. In vitro, in vivo and ex vivo characterization of ibrutinib: a potent inhibitor of the efflux function of the transporter MRP1 // Br. J. Pharmacol. ― 2014. ― 171 (24). ― Р. 5845-5857. doi: 10.1111/bph.12889
  40. Huang L., Hu C., DI Benedetto M., et al. Cross-drug resistance to sunitinib induced by doxorubicin in endothelial cells // Oncol. Lett. ― 2015. ― 9 (3). ― Р. 1287-1292. doi: 10.3892/ol.2014.2819
  41. Sato H., Siddig S., Uzu M., et al. Elacridar enhances the cytotoxic effects of sunitinib and prevents multidrug resistance in renal carcinoma cells // Eur. J. Pharmacol. ― 2015. ― 746. ― Р. 258-266. doi: 10.1016/j.ejphar.2014.11.021
  42. Lan C.Y., Wang Y., Xiong Y., et al. Apatinib combined with oral etoposide in patients with platinum-resistant or platinum-refractory ovarian cancer (AEROC): a phase 2, single-arm, prospective study // Lancet Oncol. ― 2018. ― 19 (9). ― Р. 1239-1246. doi: 10.1016/S1470-2045(18)30349-8
  43. Wang L., Liang L., Yang T., et al. A pilot clinical study of apatinib plus irinotecan in patients with recurrent high-grade glioma: Clinical Trial/Experimental Study // Medicine (Baltimore). ― 2017. ― 96 (49). ― Р. 9053. doi: 10.1097/MD.0000000000009053
  44. Abou-Alfa G.K., Shi Q., Knox J.J., et al. Assessment of Treatment With Sorafenib Plus Doxorubicin vs Sorafenib Alone in Patients With Advanced Hepatocellular Carcinoma: Phase 3 CALGB 80802 Randomized Clinical Trial // JAMA Oncol. ― 2019. ― 5 (11). ― Р. 1582-1588. doi: 10.1001/jamaoncol.2019.2792
  45. Sheng X., Cao D., Yuan J., et al. Sorafenib in combination with gemcitabine plus cisplatin chemotherapy in metastatic renal collecting duct carcinoma: A prospective, multicentre, single-arm, phase 2 study // Eur. J. Cancer. ― 2018. ― 100. ― Р. 1-7. doi: 10.1016/j.ejca.2018.04.007
  46. Chow L.W., Xu B., Gupta S., et al. Combination neratinib (HKI-272) and paclitaxel therapy in patients with HER2-positive metastatic breast cancer // Br. J. Cancer. ― 2013. ― 108 (10). ― Р. 1985-1993. doi: 10.1038/bjc.2013.178
  47. Di Leo A., Gomez H.L., Aziz Z., et al. Phase III, double-blind, randomized study comparing lapatinib plus paclitaxel with placebo plus paclitaxel as first-line treatment for metastatic breast cancer // J. Clin. Oncol. ― 2008. ― 26 (34). ― Р. 5544-5552. doi: 10.1200/JCO.2008.16.2578
  48. Reck M., Kaiser R., Mellemgaard A., et al. LUME-Lung 1 Study Group. Docetaxel plus nintedanib versus docetaxel plus placebo in patients with previously treated non-small-cell lung cancer (LUME-Lung 1): a phase 3, double-blind, randomised controlled trial // Lancet Oncol. ― 2014. ― 15 (2). ― Р. 143-155. doi: 10.1016/S1470-2045(13)70586-2
  49. Yi J.H., Lee J., Lee J., et al. Randomised phase II trial of docetaxel and sunitinib in patients with metastatic gastric cancer who were previously treated with fluoropyrimidine and platinum // Br. J. Cancer. ― 2012. ― 106 (9). ― Р. 1469-1474. doi: 10.1038/bjc.2012.100