© А.Д. Гафиуллина, З.А. Афанасьева, З.И. Абрамова, 2024
УДК 618.11-006.6:616-091.818:576.385.5
А.Д. Гафиуллина1,2, З.А. Афанасьева1,2, З.И. Абрамова3
1ГАУЗ «Республиканский клинический онкологический диспансер МЗ Республики Татарстан им. проф. М.З. Сигала», г. Казань
2Казанская государственная медицинская академия ― филиал ФГБОУ ДПО РМАНПО МЗ РФ, г. Казань
3ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет», г. Казань
Гафиуллина Алия Дамировна ― аспирант кафедры онкологии, радиологии и паллиативной медицины Казанской государственной медицинской академии ― филиала ФГБОУ ДПО РМАНПО МЗ РФ, врач-онколог онкологического отделения №7 ГАУЗ «Республиканский клинический онкологический диспансер МЗ Республики Татарстан им. проф. М.З. Сигала»
420029, г. Казань, Сибирский тракт, д. 29, тел. +7-960-053-73-75, e-mail: gafiullina.aliya@mail.ru, ORCID ID: 0000-0002-82470161X, SPIN-код: 4985-1607
Реферат. Молекулярные маркеры являются важным инструментом для определения неблагоприятного исхода при раке яичников. Этот вид рака имеет самые высокие показатели летальности среди гинекологических раков, связанной с поздней диагностикой. Проведенное исследование показало, что на прогноз заболевания влияют не только стадия и распространенность опухоли, огромное значение имеет биология опухоли, в частности состояние аутофагии и апоптоза. Белки аутофагии Lc3b1, Lc3b2, Beclin-1 и апоптоза Bсl-2, Casp-3 в ткани яичника определялись методом вестерн-блоттинга. Были выявлены два белка Bcl-2 и Lc3b1 в качестве молекулярных маркеров, которые оказались индикаторами агрессивности течения заболевания или факторами прогноза при раке яичников.
Ключевые слова: аутофагия, апоптоз, рак яичников, белки Bсl-2, Lc3b1, Lc3b2, Casp-3, Beclin-1.
Введение
Рак яичников (РЯ) является самой агрессивной гинекологической злокачественной опухолью. Поздняя диагностика, гетерогенность опухоли и развитие химиорезистентности способствуют высокой летальности пациенток [1, 2]. Всего около 19% случаев рака яичников диагностируется на ранней стадии [3, 4]. Помимо этого, в 80% случаев заболевания развивается рецидив после комбинированной терапии, что связано с развитием резистентности опухоли к лекарственной терапии. Резистентность к терапии может быть вызвана различными факторами, такими как мутации в определенных генах, синтез белков теплового шока, синтез определенных белков, а также нарушение функции аутофагии и апоптоза [5]. Успешное лечение рака яичников требует не только ранней диагностики, но и преодоления резистентности опухоли к лекарственному лечению, поэтому важно изучать молекулярные механизмы, которые играют роль в развитии резистентности. Некоторые исследования указывают на то, что молекулярные модуляторы аутофагии и апоптоза, нацеленные на конкретные мишени этих процессов, могут иметь потенциал в качестве терапевтических средств [6-10]. Комплексное изучение молекулярных механизмов аутофагии и апоптоза при раке яичников может способствовать пониманию роли этих процессов в развитии химиорезистентности опухоли и поиску новых подходов к лечению и прогнозированию заболевания [11]. Значимость исследования этих процессов заключается в возможности применения полученных результатов для диагностики и прогнозирования агрессивности рака яичников, а также для его лечения.
Цель исследования ― определить прогностически значимые белки аутофагии и апоптоза при раке яичников.
Материал и методы
Исследование проводилось на базе Республиканского клинического онкологического диспансера им. проф. М.З. Сигала, в онкологическом отделении №7. Для анализа уровней белков аутофагии и апоптоза в образцах тканей рака яичника был взят материал у 79 пациенток с раком яичников.
Пациенткам проведено 395 молекулярно-биологических исследований. Критериями исключения из исследования были: наличие тяжелых сопутствующих заболеваний, ВИЧ, психические расстройства и полинеоплазии. Материал ткани яичника был получен во время плановых хирургических вмешательств в условиях онкологического отделения. Все пациентки прошли комплексное обследование, включающее УЗИ, компьютерную и магнитно-резонансную томографию органов брюшной полости и малого таза, РКТ грудной клетки, видеогастродуоденоскопию, видеоколоноскопию, анализ уровней онкомаркеров Ca-125, HE-4 в крови. По результатам обследования пациенткам был назначен и проведен общепринятый вариант комбинированного лечения, который включал операцию + химиотерапию либо химиотерапия + операция + химиотерапия. Эффективность каждого этапа комбинированного лечения оценивалась по общепринятым протоколам с использованием лабораторно-инструментальных методов диагностики. У 79 пациенток с раком яичников были определены белки аутофагии и апоптоза Beclin-1, Lc3b1, Lc3b2, Bcl-2, Casp-3.
Возраст пациенток, принявших участие в исследовании, был от 42 до 83 лет, причем рак яичников в нашем исследовании был характерен для женщин после менопаузы (75%), что совпадает с данными литературы [5, 12]. Индекс массы тела (ИМТ) у пациенток колебался от 24,9 до 35 кг/м2. Основное количество составили пациентки с избыточной массой тела (78%).
В таблице 1 представлено распределение пациенток с РЯ по стадиям FIGO.
Таблица 1. Распределение пациенток с РЯ по стадиям FIGO
Table 1. Distribution of patients with ovarian cancer by FIGO stages
| Стадии FIGO | N | % |
| I стадия | 7 | 8,0 |
| II и III стадии | 61 | 78,0 |
| IV стадия | 11 | 14,0 |
| Всего | 79 | 100,0 |
Из таблицы видно, что на момент выявления РЯ большинство пациенток (92%) имели распространенную стадию заболевания, то есть имели диссеминированный процесс, что согласуется с данными литературы [13, 14].
В данной выборке серозный рак яичников является наиболее распространенной морфологической формой опухоли, составляя 87% от общего числа случаев, на долю эндометриоидного, светлоклеточного и муцинозного рака пришлось соответсвенно 13%.
Полная циторедукция была достигнута у 54% пациенток. Оптимальная циторедукция зарегистрирована у 28% пациенток. В 18% случаев произведена неоптимальная циторедукция. Все пациентки получили 6 курсов химиотерапии по схеме ТС (паклитаксел + карбоплатин).
Определение белков аутофагии и апоптоза в ткани рака яичников
Белки аутофагии и апоптоза определялась в научно-исследовательской лаборатории (НИЛ) молекулярных основ патогенеза и терапии опухолевых заболеваний кафедры биохимии, биотехнологии и фармакологии Института фундаментальной медицины и биологии ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» методом вестерн-блоттинга. Белковые лизаты получали из замороженных фрагментов карциномы яичников, которые затем обрабатывались специальными буферами и разделялись методом электрофореза с использованием полиграфного геля. После электрофореза белки переносились на мембрану из нитрилцеллюлозы при помощи трансфера, также известного как иммуноблоттинг. На мембране образовывался набор полос, соответствующих размеру белков. Затем мембрана инкубировалась с антителами, специфичными для исследуемых белков аутофагии и апоптоза, которые связывались с соответствующими полосами белков. После инкубации с первичными антителами мембрана инкубировалась с вторичными антителами, содержащими флуорофорный краситель, для обнаружения комплекса антитело-белок. Затем целевые белки визуализировались и измерялись с использованием спектрофотометрии для определения точного количества белка в каждой пробе. Концентрация белков выражалась в условных единицах (у.е.). Для нормализации данных и контроля загрузки использовался белок Vinculin (VCL) с целью проверки и сравнения уровня других белков в пробе. Кроме того определяли Ratio или k как одна из важнейших характеристик процесса аутофагии. Ratio является соотношением показателей Lс3b1/Lc3b2 и обозначается как коэффициент активности аутофагии (k или ratio).
Для выбора белков в качестве диагностических или прогностических маркеров применялась простая логистическая регрессия. ROC-анализ с использованием ROC-кривых и площади под кривой AUC использовался для оценки предсказательных способностей моделей. Для анализа выживаемости строились кривые Каплана ― Мейера и использовалась регрессия пропорциональных рисков Кокса. Результаты представлялись с помощью отношения рисков (HR), доверительных интервалов и p-value. Уровень значимости был определен как p<0,05, и доверительные интервалы строились с использованием 95% интервала.
Для расчета размера выборки использовалось программное обеспечение R версии 4.2.2 с пакетами.
Результаты
Для создания модели прогнозирования общей выживаемости на основе уровня белков аутофагии и апоптоза при карциноме яичников, мы использовали логистическую регрессию, и результаты, которые мы получили для отношения шансов (OR ― odds ratio) и p-value каждого из белков, представлены в таблице 2.
Таблица 2. Отношение шансов (OR) и p-value по белкам аутофагии и апоптоза больных РЯ
Table 2. Odds ratio (OR) and p-value for autophagy and apoptosis proteins in ovarian cancer patients
| Белки | OR | p-value |
| Bcl-2 | 0,011 | 0,021 |
| Beclin-1 | 0,637 | 0,13 |
| Casp-3 | 0,788 | 0,44 |
| Lc3b1 | 1,486 | 0,028 |
| Lc3b2 | 0,265 | 0,039 |
| k или Ratio | 1,099 | 0,008 |
ROC-анализ с построением ROC-кривых
Все белки, кроме Beclin-1 и Casp3, можно включить в ROC-анализ для определения точности и порогового уровня.
В таблице 3 представлены показатели AUC в зависимости от белка аутофагии и апоптоза с использованием 95% ДИ.
Таблица 3. Показатели AUC белков аутофагии и апоптоза с 95% доверительным интервалом (ДИ)
Table 3. AUC values of autophagy and apoptosis proteins with 95% confidence interval (CI)
| Белки | AUC | 95% ДИ |
| BCL2 | 0,865 | 0,773 – 0,958 |
| LC3B1 | 0,768 | 0,647 – 0,888 |
| LC3B2 | 0,698 | 0,546 – 0,85 |
| Ratio | 0,819 | 0,703 – 0,934 |
На рисунке 1 представлены ROC-кривые по уровням белков аутофагии и апоптоза у пациенток с карциномой яичников.
Рис. 1. ROC-кривые по уровням белков аутофагии и апоптоза у пациенток с карциномой яичников. Синий ― Bcl-2, зеленый ― Lc3b1, красный ― Lc3b2, оранжевый ― Ratio (k)
Fig. 1. ROC curves for the levels of autophagy and apoptosis proteins in patients with ovarian carcinoma. Blue ― Bcl-2, Green ― Lc3b1, Red ― Lc3b2, Orange ― Ratio (k)
Кривые сглажены (для лучшей визуализации), поэтому уровень AUC отличается от табличного (рассчитан по ступеням).
Так как модель на основе Lc3b2 имеет низкие показатели AUC, а также при сравнении с моделью Bcl-2 (р=0,06896), то было принято решение не включать Lc3b2 в дальнейший анализ.
Определение пороговых точек с определением чувствительности и специфичности
В таблице 4 представлен пороговый уровень белков Bcl-2, Lc3b1, Ratio (k) с определением чувствительности и специфичности.
Таблица 4. Пороговый уровень белков Bcl-2, Lc3b1, Ratio (k) с определением чувствительности и специфичности
Table 4. Threshold level of Bcl-2, Lc3b1, Ratio (k) proteins with determination of sensitivity and specificity
| Белки | Пороговый уровень | Чувствительность | Специфичность |
| Bcl-2 | 0,206 | 86,67 | 80,95 |
| Lc3b1 | 2,354 | 93,75 | 59,52 |
| Ratio | 2,63 | 93,75 | 59,52 |
Как видно из таблицы, достаточно высокой чуствительностью и специфичностью обладает Bcl-2, однако Lc3b1 и Ratio (k) обладают большей чувствительностью, что может быть полезно только для предсказания летального исхода. В соответствии с выявленными порогами все пациенты были дополнительно разделены на группы «высокий» и «низкий» уровень по каждому из белков.
Анализ выживаемости с учетом уровня белков Bcl-2, Lc3b1 и LC3-I/LC3-II (k)
Для определения и подтверждения прогностических способностей белков для общей выживаемости был выполнен анализ выживаемости пациенток с РЯ.
На рисунке 2 отображена общая выживаемость по Каплану ― Мейеру больных РЯ в зависимости от уровня белка Bcl-2.
Рис. 2. Кривые Каплана ― Мейера для групп Bcl-2
Fig. 2. Kaplan ― Meyer curves for Bcl-2 groups
На рисунке 3 отображена общая выживаемость по Каплану ― Мейеру больных РЯ в зависимости от уровня белка Lc3b1.
Рис. 3. Кривые Каплана ― Мейера для групп Lc3b1
Fig. 3. Kaplan ― Meyer curves for Lc3b1 groups
На рисунке 4 отображена общая выживаемость по Каплану ― Мейеру больных РЯ в зависимости от уровня Ratio.
Рис. 4. Кривые Каплана ― Мейера для групп Ratio
Fig. 4. Kaplan ― Meyer curves for Ratio groups
В таблице 5 представлена 3-летняя общая выживаемость пациенток РЯ с учетом уровня белков Bcl-2 и Lc3b1 значения Ratio (k).
Таблица 5. Трехлетняя общая выживаемость пациенток РЯ с учетом уровня белков Bcl-2 и Lc3b1 значения Ratio (k)
Table 5. Three-year overall survival of ovarian cancer patients, taking into account the level of Bcl-2 and Lc3b1 proteins of the Ratio (k) value
| Факторы | 3-летняя ОВ | 95% ДИ |
| Bcl-2 | – | – |
| «Высокий» | 92% | 79 – 100 |
| «Низкий» | 15% | 3,2 – 72 |
| Lc3b1 | – | – |
| «Высокий» | 21% | 7,5 – 59 |
| «Низкий» | 92% | 79 – 100 |
| Ratio | – | – |
| «Высокий» | 17% | 3,9 – 79 |
| «Низкий» | 92% | 77 – 100 |
Как следует из таблицы и рисунков 2, 3, 4, прогностически благоприятными факторами являются высокий уровень белка Bcl-2, низкий уровень Lc3b1 и низкий Ratio (k). Мы, как и K. Archana и соавторы (2022), показали, что низкий Bcl-2 связан с прогрессией опухоли и может быть полезным в прогнозе заболевания.
В таблице 6 отображены результаты однофакторной регрессии Кокса.
Таблица 6. Результаты однофакторной регрессии Кокса
Table 6. Results of single-factor Cox regression
| Факторы | HR | 95%ДИ | p-value |
| Bcl-2 | 0,007 | 7,62 – 0,58 | 0,028 |
| «Низкий» Bcl-2 | 7,338 | 1,727 – 31,17 | 0,007 |
| Lc3b1 | 1,354 | 1,003 – 1,828 | 0,048 |
| «Низкий» Lc3b1 | 0,168 | 0,04 – 0,709 | 0,015 |
| Ratio | 1,034 | 0,992 – 1,079 | 0,116 |
| «Низкий» Ratio | 0,181 | 0,043 – 0,761 | 0,02 |
HR<1 свидетельствует, что при изменении категории (с высокого уровня на низкий) или уровня (на единицу выше) риск летального исхода снижается. HR>1 свидетельствует, что при изменении категории (с высокого уровня на низкий) или уровня (на единицу выше) риск летального исхода повышается.
Использование групп, сформированных по ROC-анализу, и небольшое количество событий в них не являются корректными для оценки HR (отношения рисков), что также отражается в широких ДИ. Это может послужить темой для будущих исследований, где данное деление белков на группы будет перепроверяться на новых выборках.
Таким образом, нами было получено, что белки, определяемые в ткани карциномы яичника Bcl-2, Lc3b1, и соотношение белков LC3I/LC3II (k) действительно могут обладать прогностической способностью в отношении общей выживаемости при РЯ, то есть являться факторами прогноза.
Поэтому дополнительно были оценены уровни белков без деления на группы. По результатам показатель Ratio оказался незначим. Таким образом, мы можем констатировать, что Bcl-2, Lc3b1 и деление пациенток на группы с высокими и низкими уровнями этих белков обладают прогностической способностью в отношении общей выживаемости.
Обсуждение
Была создана модель по прогнозированию общей выживаемости по уровню белков аутофагии и апоптоза при карциноме яичников, благодаря которой выявлены белки с достаточно высокой чуствительностью и специфичностью. Для определения и подтверждения прогностических способностей белков аутофагии и апоптоза для общей выживаемости был выполнен анализ выживаемости пациенток с РЯ, и с помощью регрессии Кокса было доказано, что белки, определяемые в ткани карциномы яичника Bcl-2, Lc3b1, действительно обладают прогностической способностью в отношении общей выживаемости при РЯ, то есть являются факторами прогноза. Полученные нами результаты согласуются с данными других исследователей [16, 17], которые пишут о том, что эти белки могут оказаться полезными для индивидуализированной терапии рака яичников в клинической практике. Лекарственные препараты, нацеленные на модуляцию аутофагии, возможно, изменят результаты лечения этого агрессивного рака у женщин.
Нам еще предстоит достичь всестороннего понимания механизма аутофагии в возникновении и развитии РЯ для разработки новых клинических биомаркеров с целью мониторинга аутофагии, успешного поиска агентов, обладающих эффективными терапевтическими сроками воздействия и подавляющих вспять лекарственную устойчивость с помощью комбинированного лечения [18].
Заключение
Пациенткам, больным раком яичников и имеющим неблагоприятные прогностические факторы, такие как повышенный уровень белка аутофагии Lc3b1 и сниженный уровень белка апоптоза Bcl-2, рекомендуется проводить индивидуализированное диспансерное наблюдение. Профилирование уровней специфических белков-маркеров аутофагии и апоптоза, учитывая предсказательность течения заболевания и изменение чувствительности опухоли в процессе лекарственной терапии по этим белкам, может быть эффективным инструментом в прогнозировании исхода заболевания и назначении персонифицированного лечения.
Информация об источнике поддержки в виде грантов, оборудования, лекарственных препаратов: работа выполнена за счет собственных средств.
Финансовой поддержки в виде грантов, а так же со стороны компаний – производителей лекарственных препаратов и медицинского оборудования авторы не получали.
Конфликт интересов: отсутствует.
Литература
- Matulonis U.A., Sood A.K, Fallowfield L., et al. Ovarian cancer // Nat. Rev. Dis. Primers. ― 2016. ― Aug 25. ― 2. ― P. 16061.
- Oswald A.J., Gourley C. Low-grade epithelial ovarian cancer: a number of distinct clinical entities? // Curr Opin Oncol. ― 2015. ― Sep. ― 27 (5). ― P. 412-9.
- Witkowski L., Goudie C., Ramos P., et al. The influence of clinical and genetic factors on patient outcome in small cell carcinoma of the ovary, hypercalcemic type // Gynecol Oncol. ― 2016. ― Jun. ― 141 (3). ― P. 454-460.
- Cabasag C.J., Fagan P.J., Ferlay J., et al. Ovarian cancer today and tomorrow: A global assessment by world region and Human Development Index using GLOBOCAN 2020 // Int. J. Cancer. ― 2022. ― Nov 1. ― 151 (9). ― P. 1535-1541.
- Kavya Satheesh K.S., Rani H., Jolly M.K., Mahadevan V. Epigenetics of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in cancer / in Translational Epigenetics, Epigenetics and Metabolomics, Academic Press. ― 2021. ― Vol. 28. ― P. 237-264.
- Levy J.M.M., Towers C.G.,Thorburn A. Targeting autophagy in cancer // Nature Reviews Cancer. ― 2017. ― Vol. 17, №9. ― P. 528-542.
- Nagelkerke A., Sweep F.C., Geurts-Moespot A., et al. Therapeutic targeting of autophagy in cancer. Part I: molecular pathways controlling autophagy // Semin Cancer Biol. ― 2015. ― Apr. ― 31. ― P. 89-98.
- Yang X., Yu D.D., Yan F. The role of autophagy induced by tumor microenvironment in different cells and stages of cancer // Cell and Bioscience. ― 2015. ― Vol. 5, №1. ― P. 14.
- Zhao Z., Xue J., Zhao X., et al. Prognostic role of autophagy-related proteins in epithelial ovarian cancer: a meta-analysis of observational studies // Minerva Med. ― 2017. ― Jun. ― 108 (3). ― P. 277-286.
- Yang L., Xie H.J., Li Y.Y., et al. Molecular mechanisms of platinum-based chemotherapy resistance in ovarian cancer (Review) // Oncol Rep. ― 2022. ― Apr. ― 47 (4). ― P. 82.
- Klionsky D.J., Gatica D., Hawkins W.D. et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition) // Autophagy. ― 2021. ― Vol. 17, №1. ― P. 1-382.
- Злокачественные новообразования в России в 2021 году (заболеваемость и смертность) / Под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, А.О. Шахзадовой. ― М.: МНИОИ им. П.А. Герцена ― филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, 2022. ― 252 с.
- Урманчеева А.Ф., Мешкова И.Е. Вопросы эпидемиологии и диагностики рака яичников // Практическая онкология. ― 2000. ― №4. ― С. 7-13.
- Bast R.C. Jr., Lu Z., Han C.Y., et al. Biomarkers and Strategies for Early Detection of Ovarian Cancer // Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. ― 2020. ― Dec. ― 29 (12). ― P. 2504-2512.
- Archana J.K., Das N.M. Bcl-2 expression and its correlation with histopathological features in ovarian surface epithelial tumours // Journal of Evolution of Medical and Dental Sciences. ― 2022. ― Vol. 11, №3. ― P. 420-424.
- Yuan J., Lan H., Jiang X., et al. Bcl-2 family: Novel insight into individualized therapy for ovarian cancer (Review) // Int. J. Mol Med. ― 2020. ― Oct. ― 46 (4). ― P. 1255-1265.
- Chen X., Sun Y., Wang B., Wang H. Prognostic significance of autophagy-related genes Beclin1 and LC3 in ovarian cancer: a meta-analysis // J. Int. Med. Res. ― 2020. ― Nov. ― 48 (11).
- Liu J.T., He Y. et al. Inhibition LC3B can increase chemosensitivity of ovarian cancer cells // Cancer Cell International. ― 2019. ― Vol. 19, №1. ― P. 199.