КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ НАНОВЕЗИКУЛ С ПОМОЩЬЮ AUNP-АПТАСЕНСОРА: НОВЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ ДИАГНОСТИКИ РАКА ЖЕЛУДКА

УДК 616.33-006.6-07

Л.М. Забегина¹, М.А. Беляев², К.Е. Кацуба¹, А.В. Шалаев¹, Д.С. Плевако¹, А.Ю. Гаранин¹, Л.А. Логвин², А.А. Свечкова², В.В. Шаройко², А.В. Малек¹

¹ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Петрова» МЗ РФ, г. Санкт-Петербург

²ФГБОУ ВО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова» МЗ РФ, г. Санкт-Петербург

Малек Анастасия Валерьевна ― доктор медицинских наук, заведующая научной лабораторией субклеточных технологий с группой онкоэндокринологии, врач-трансфузиолог ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Петрова» МЗ РФ

197758, г. Санкт-Петербург, пос. Песочный, ул. Ленинградская, д. 68, e-mail: anastasia@malek.com.ru

Реферат

Цель исследования ― оценка технической возможности и клинического потенциала метода количественного анализа «маркерных» популяций внеклеточных нановезикул (ВНВ) в плазме и жидкости перитонеального смыва с целью диагностики рака желудка (РЖ).

Материал. Биологические образцы пациентов с верифицированным диагнозом РЖ (n=21), пациентов с хроническим холециститом (n=8) и здоровых доноров (n=6).

Методы. Выделение ВНВ проводили с помощью ультрацентрифугирования и двухфазной полимерной системы, размер и концентрацию ВНВ исследовали с помощью анализа траекторий наночастиц, наличие характерных «экзосомальных» маркеров в составе везикулярной мембраны исследовали с помощью проточной цитометрии, количественный анализа «маркерных» популяций ВНВ провели с помощью ранее разработанного AuNP-аптасенсора. Принцип работы AuNP-аптасенсора основан на феномене обратимого ингибирования фермент-миметической активности наночастиц золота в результате неспецифической сорбции ДНК-аптамеров. В рамках исследования были использованы пять разных ДНК-аптамеров, что определило возможность анализа пяти разных «маркерных» молекул в составе везикулярной мембраны.

Результаты. С помощью пяти разных ДНК-аптамеров показана статистически значимая разница количества «маркерных» ВНВ в плазме пациентов с РЖ и здоровых доноров. При сравнении состава ВНВ в жидкости перитонеального смыва пациентов с РЖ и пациентов с хроническим холециститом разницы не выявлено. Но результаты анализа ВНВ, выделенных из жидкости перитонеального смыва пациентов с РЖ, коррелировали с показателем степени дифференцировки опухоли (G).

Выводы. Анализ «маркерных» ВНВ в плазме с помощью технологии AuNP-аптасенсора представляется перспективным методом скрининга или ранней диагностики заболевания (1); эта же технология может найти применения для анализа ВНВ в составе жидкости перитонеального смыва в рамках уточняющей диагностики с целью исключения/оценки риска развития перитонеальной диссеминации и выбора тактики комплексного лечения пациентов к РЖ.

Ключевые слова: рак желудка, нановезикулы, аптасенсор.

Введение

Рак желудка (РЖ) занимает пятое место в структуре онкологической заболеваемости (5,8%) и второе место в структуре онкологической смертности (9,1%) в Российской Федерации [1]. Традиционные причины относительно высокой смертности ― поздняя диагностика и низкая эффективность терапии распространенных форм заболевания. Закономерная связь показателей 5-летней выживаемости и стадии впервые установленного диагноза наблюдается по данным Американского онкологического общества (American Cancer Society): localized ― 70%, regional ― 32%, distant ― 6% [2] и Популяционного ракового регистра Санкт-Петербурга: I ст. ― 99%, II ст. ― 50%, III ст. ― 29%, IV ст. ― 8% [3]. Для большинства пациентов с РЖ, методы системной терапии являются обязательным элементом лечебных схем, принятых в европейской [4] и отечественной [5] клинической практике. С учетом появления новых лекарственных форм и препаратов таргетной терапии РЖ, актуальность приобретает задача точной оценки динамики терапевтического эффекта. Эта клиническая необходимость может быть реализована путем технологий «жидкостной биопсии». Надежные молекулярных (белковых) маркеров РЖ пока не известны, но высокий диагностический потенциал могут иметь циркулирующие мульти-молекулярные субстанции, такие как нуклеиновые кислоты, внеклеточные нановезикулы (ВНВ) или опухолевые клетки [6]. ВНВ привлекают особый интерес исследователей по двум основным причинам. Во-первых, за последние годы оптимизированы методы выделения ВНВ из биологических жидкостей [7] и разработаны инновационные технологии количественного анализа «маркерных» везикулярных популяций с помощью, например, рамановской спектроскопии [8] или аптасенсоров [9]. Во-вторых, достигнут существенный прогресс в понимании роли ВНВ в развитии РЖ [10]. Это позволяет исследовать ВНВ, выделенные из желудочного сока [11], циркулирующей плазмы [12] перитонеальных смывов [13] или асцитической жидкости [14], и разрабатывать соответствующие методы диагностики, прогнозирования или мониторинга течения заболевания. Более того, понимание молекулярных механизмов участия ВНВ в отдельных этапах развития РЖ позволяет разрабатывать новые методы терапии. Так, например, мембранная форма фермента из группы метилтрансфераз (Nicotinamide N-methyltransferase, NNMT) в составе ВНВ, секретируемых клетками РЖ, участвует в модификации мезотелия и стимуляции развития перитонеального канцероматоза [13]. В этом случае, ВНВ в перитонеальной полости и молекула NNMT в составе этих везикул представляют собой мишени терапии перитонеального канцероматоза. В другой работе была показана способность внутриклеточного фермента Е3 убиквитинлигазы угнетать пролиферативный и метастатический потенциал клеток РЖ [15]. Поэтому введение этого белка в клетки РЖ с помощью ВНВ имело терапевтический потенциал, что было убедительно продемонстрировано авторами на модели перитонеального карциноматоза у мышей.

В целом, идентификация, выделение из различных биологических жидкостей и анализ ВНВ, секретируемых клетками РЖ и/или имеющих соответствующие биохимические признаки, является актуальной исследовательской задачей. В представленном исследовании, объектом анализа служили ВНВ, выделенные из плазмы и перитонеальных смывов пациентов с РЖ. Исследование было проведено с целью оценки перспектив создания метода ранней диагностики, мониторинга терапии и прогноза развития перитонеального канцероматоза у пациентов с аденокарциномой желудка.

Материал и методы

Этические аспекты. Протокол исследования был одобрен Комитетом по этике ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова» МЗ РФ (протокол заседания №1 от 28.01.2021). Все пациенты и доноры, включенные в исследование, подписали информированное согласие. Биологические образцы и клинические данные были деперсонализированы перед началом аналитического этапа работы.

Биологические образцы. В исследование были включены пациенты с гистологически верифицированным диагнозом РЖ (n=21). Средний возраст пациентов: 65 лет (от 49 до 73 лет), стадия заболевания по системе TNM: T2-4, N0-2, M0-1. Степень дифференцировки ткани опухоли разнилась от высоко- или умеренно дифференцированной аденокарциномы (G1/2, n=4), до низко-дифференцированного (G3, n=10) и недифференцированного рака (G4, n=7). Образцы перитонеальных смывов от всех пациентов, объемом 200 мл, были получены в ходе диагностической лапароскопии. В качестве контроля были использованы образцы перитонеальных смывов пациентов с диагнозом хронический калькулезный холецистит (n=8), полученные аналогичным образом перед проведением лапароскопичекой холецистэктомии. До начала исследования образцы перитонеальных смывов хранились при +4˚C не более двух суток. В качестве группы контроля при анализе образцов плазмы, были использованы образцы плазмы здоровых доноров (n=6). Образцы венозной крови были получены от пациентов и здоровых доноров в вакутейнеры с ЭДТА (6 мл), плазма была отделена от эритроцитарной массы в течение 15 мин. после венепункции путем центрифугирования при 1500 g ― 15 мин., аликвоты образцов плазмы (2.0 мл) хранились при -80˚C.

Выделение внеклеточных нановезикул (ВНВ). Из перитонеальных смывов ВНВ были выделены стандартным методом дифференциального ультраценрифугирования с незначительными модификациями [16]. В частности, для удаления клеток и клеточного детрита жидкость последовательно центрифугировали по 20 мин. при 400 g, 800 g, и 1200 g; после каждого центрифугирования супернатант, содержащий ВНВ, переносили в чистые пробирки. Затем жидкость центрифугировали при 15000 g ― 2 часа, и полученный супернатант фильтровали через фильтр с диаметром пор 200 нм (Minisart High Flow, Sartorius, Германия), что предполагало удаление из жидкости крупных везикул и мульти-молекулярных комплексов. Из полученной жидкости ВНВ осаждали с помощью ультра-центрифугирования (110 000 g ― 8 часов), полученный осадок ресупендировали в фосфатно-солевом буфере, и ультра-центрифугировали повторно (110 000 g ― 2 часа). Осадок, содержащий ВНВ, ресуспендировали в 100 мкл фосфатно-солевого буфера.

Для выделения ВНВ из плазмы, образцы медленно размораживали, трижды центрифугировали по 10 мин. при 300 g, 1500 g, и 2500 g, каждый раз перенося супернатант в чистую пробирку, затем фильтровали через фильтр с размером пор 200 нм. ВНВ выделяли из очищенной от клеточного детрита плазмы с помощью двухфазной полимерной системы, согласно описанному ранее протоколу [17] с незначительными модификациями. Полимеры, декстран 450-650 кДа (Sigma-Aldrich, США) и поли-этиленгликоль 35 кДа (Sigma-Aldrich, США), растворяли в 1,5 мл плазмы и в 1,5 мл фосфатно-солевого буфера (ФСБ) при медленном перемешивании в течение часа. Финальная концентрация декстрана в полученных растворах составляла 3,5%, полиэтиленгликоля ― 1,5%. Для разделения фаз растворы полимеров в плазме и ФСБ центрифугировали (1000 g ― 10 мин.). При этом ВНВ концентрировались в нижней фазе, а белки плазмы ― в верхней. Затем верхнюю фазу, сформированную в плазме, удаляли и замещали верхней фазой, сформированной в ФСБ. Раствор перемешивали и повторно разделяли фазы путем центрифугирования. После повторного удаления верхней фазы, содержащей белки плазмы, нижнюю фазу, содержащую ВНВ, ресуспендировали в 100 мкл ФСБ.

Оценка размера и концентрации ВНВ. Оценку размера и концентрации тотальной популяции ВНВ, выделенных из образцов плазмы и перитонеальных смывов, проводили с помощью анализа траекторий наночастиц. Измерения осуществляли на анализаторе Nanosight NS300 (Malvern Panalytical, Великобритания). Уровень камеры: 10, ползунок затвора: 696, усиление ползунка: 55, пороговый уровень ― 5. Каждый образец прокачивался через камеру наблюдения анализатора так, чтобы провести 5 измерений на разных микрообъемах одного и того же образца. Каждое измерение длилось 30 с, включало 749 кадров. По результатам пяти измерений проводился расчет средних значений размера и концентрации наночастиц в суспензии.

Детекция поверхностных маркеров ВНВ с помощью «on–bead» цитометрии. Подготовка образцов включала неспецифическую сорбцию ВНВ на поверхности латексных частиц размером 4 мкм (Invitrogen, США): к 100 мкл ВНВ (концентрация 10¹¹ частиц/мл) добавляли 5 мкл латексных частиц (концентрация 0,04 мг/мкл) и инкубировали в течение ночи при 4°C при постоянном перемешивании. Частицы трижды отмывали от несвязанных ВНВ путем ресуспендирования в 100 мкл ФСБ и последующего осаждения при 4500 g. Затем частицы, на поверхности которых были фиксированы ВНВ, инкубировали с антителами, конъюгированными с флуоресцентными метками: CD9-FITC (ab18241, Abcam, Великобритания), CD63-PE (353004, BioLegend, США) и CD81-PerCP (349508, BioLegend, США) ― 2 часа при 4°C при концентрации антител 1 мг/мл. После отмывки частиц от несвязанных антител (аналогично отмывке латексных частиц от несвязанных ВНВ), детекцию проводили на проточном цитометре Cytoflex (Beckman Coulter, США), оборудованном аргоновым лазером с длинной волны 488 нм.

Полуколичественная оценка РЖ-ассоциированных ВНВ. Анализ специфической популяции ВНВ, предположительно секретируемых клетками РЖ, в составе тотальной везикулярных популяций, выделенных из плазмы и перитонеальных смывов, осуществляли с использованием аптасенсора на основе наночастиц золота и ДНК аптамеров [18]. Синтез наночастиц (AuNP) проводился согласно ранее описанному протоколу [19]. Последовательности ДНК-аптамеров были получены в ходе анализа литературных данных, синтез аптамеров был произведен ООО «Люмипроб РУС» и ООО «Синтол» (РФ). Последовательности и соответствующие публикации представлены в таблице 1. Для формирования комплекса AuNP-аптамер, к 10 мкл суспензии AuNP (концентрация 2×10¹⁵ частиц/мл) добавляли 2,5 мкл р-ра аптамера (100 пмоль/мкл) и инкубировали 30 мин. при 4°C. При добавлении р-ра аптамера к суспензии AuNP происходила их неспецифическая сорбция на поверхности наночастиц и обратимое угнетение их пероксидазной активности. Далее в реакционную смесь вносили 1 мкл суспензии ВНВ (концентрация 10⁸/мл) и инкубировали 30 мин. при 4°C. Согласно принципу работы аптасенсора, при добавлении ВНВ происходило перераспределение аптамеров между поверхностью AuNP и ВНВ из-за аффинного и специфического взаимодействия аптамеров с белками в составе везикулярной мембраны. Освобождение поверхности AuNP сопровождалось пропорциональным восстановлением их пероксидазной активности. Количественная оценка восстановленной пероксидазной активности проводилась с помощью цветной реакции окисления 3,3′,5,5′-тетраметилбензидина / ТМБ ООО «ХЕМА», РФ). Субстрат добавляли в объеме 10 мкл, инкубировали 18 мин. при 37°C в темноте. Полученную суспензию центрифугировали (6000 g ― 3 мин.) для осаждения крупных компонентов реакции, супернатант аккуратно переносили в 384 луночный планшет и измеряли интенсивность абсорбции при 370 нм на планшетном ридере Varioscan LUX (Thermo Fisher Scientific, США). Положительный контроль, при котором AuNP обладают максимальным уровнем пероксидазной активности, определяли добавляя ТМБ к немодифицированным AuNP. Отрицательный контроль, где AuNP «полностью покрыты» аптамерами при концентрации 20 пмоль/мкл, и проявляют минимальный уровень пероксидазной активности определяли, добавляя ТМБ к комплексу AuNP-аптамер.

Обработка и анализ данных. Моделирование вторичной структуры ДНК-аптамеров было проведение с помощью доступного on-line алгоритма (https://bio.tools/mfold). Анализ экспериментальных данных осуществляли в программах Nanosight NTA 3.4, CytExpert, OriginPro 9.1. Статистические различия между группами определяли с помощью непараметрического критерия Манна ― Уитни и Краскел ― Уоллиса.

Результаты

Выделение и характеристика тотальной популяции ВНВ. Выбор метода выделения ВНВ из плазмы был сделан с учетом опыта предыдущих исследований [17], который подтвердил эффективность и экономичность технологии на основе двухфазной полимерной системы. Эта технология не адоптирована к задаче выделения ВНВ из перитонеальных смывов, поэтому в этом случае был использован стандартный метод ультра-центрифугирования. Размер и концентрацию выделенных ВНВ оценивали с помощью анализа траекторий наночастиц (АТН). ВНВ, полученные из смывов отличались значительным разбросом по размерам: от 100 до 300 нм, и имели концентрацию 1 – 4×10¹¹ частиц/мл. Размер ВНВ, выделенных из плазмы, ожидаемо лежал в диапазоне от 60 до 100 нм, концентрация ― в диапазоне 2 – 6×10¹¹ частиц/мл. Репрезентативные примеры анализа тотальной популяции ВНВ из перитонеальных смывов и плазмы представлены на рисунках 1А и 1Б, соответственно.

Рис. 1. Характеристика общей популяции ВНВ. Репрезентативные примеры результатов оценки размера и концентрации ВНВ, выделенных из перитонеального смыва (А) и плазмы (Б), с помощью технологии анализа траекторий наночастиц (АТН). Репрезентативные примеры оценки маркеров CD9 (В), CD63 (Г) и CD81 (Д) на поверхности ВНВ, выделенных из перитонеального смыва, с помощью технологии «on-bead» проточной цитометрии

Fig. 1. Characteristics of total population of small extracellular vesicles (SEV). Representative examples of the results of SEV assessment using nanoparticle tracking analysis (NTA). SEV were isolated from peritoneal flushing (A) and plasma (B). Representative examples of evaluation of CD9 (B), CD63 (Г) and CD81 (D) markers on the surface of the SEV using «on-bead» flow cytometry. SEV were isolated from the liquid obtained by diagnostic peritoneal lavage

Полученные результаты указывают на присутствии в жидкости перитонеальных смывов относительно большого количества крупных частиц, которые могли быть представлены клеточным детритом, крупными везикулами или мультивезикулярными конгломератами. Преобладание последнего варианта частиц ставило под сомнение эффективность последующего применения AuNP-аптасенсора. С учетом полученных данных АТН для последующих этапов анализа были выбраны образцы со средним размером выделенных везикул до 200 нм. Так, из 21 образца жидкости было получено 15 образцов ВНВ с удовлетворительными размерами (100-200 нм), остальные образцы были исключены из анализа. ВНВ, выделенные из плазмы, представляли собой относительно гомогенную популяцию, поэтому все образцы везикул плазмы были включены в дальнейшую работу.

Детекцию тетраспанинов CD9, CD63 и CD81, в составе мембраны выделенных ВНВ осуществляли методом «on-bead» проточной цитометрии (рис. 1В-Д): во всех случаях популяции анализируемых везикул содержали везикулярные маркеры. Исходя из полученных результатов, можно предположить, что в составе выделенных ВНВ присутствуют везикулы эндосомального происхождения ― так называемые «экзосомы». Задача получения «чистой» популяции экзосом в рамках исследования не ставилась.

Подбор и тестирование ДНК-аптамеров. Аптамеры представляют собой короткие олигонуклеотидные последовательности, способные с высокой аффинностью взаимодействовать с белковыми мишенями. Используя процесс систематической эволюции лигандов экспоненциальным обогащением, или SELEX, аптамеры могут быть подобраны практически к любой мишени [20]. На основе анализа литературных данных нами были выбраны пять ДНК-аптамеров полученных в ходе SELEX разными исследовательскими группами (табл. 1).

Таблица 1. Использованные в исследовании аптамеры

Table 1. Aptamers used in the study

Название	Последовательность 5′ → 3′	Лиганд	Ссылка
PDGC21-T	ACACCAAAATCGTCCGTTTCGTTTTAGTCCGTCTCTTTAGGGTGT	BGC-823	[21]
S4a	GATCTCTCTCTGCCCTAAGTCCGCACCCGTGCTTCCCTGT	SGC7901	[22]
Seq-3	CTATAGCAATGGTACGGTACTTCCCCTCGGCACGTTCTCAGTAGCGCTCGCTGGTCATCCCACACAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA	сыворотка	[23]
Seq-6	CTATAGCAATGGTACGGTACTTCCCCAAGCTAACCCCCATCTGCGCGCTCCTCAGTAGCGCTGCCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA	сыворотка	[23]
Seq-19	CTATAGCAATGGTACGGTACTTCCATGGTACGGTACTTCCAAGCTAACCCCCATCTGCGCGCTCCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA	сыворотка	[23]

В качестве лигандов для синтеза данных аптамеров использовались: клетки низкодифференцированного РЖ BGC-823 (аптамер PDGC21-T), клетки аденокарциномы желудка SGC7901 (аптамер S4a) и сыворотка крови пациентов с РЖ (аптамеры Seq-3, Seq-6 и Seq-19). Используя онлайн сервер mfold, для выбранных аптамеров были предсказаны наиболее вероятные вторичные структуры (рис. 2А). Полученные результаты указывают на разнообразие вторичных структур, которые могут формировать выбранные аптамеры, что позволяет предполагать их взаимодействие с различными маркерами на поверхности клеток РЖ и, соответственно, везикул, секретируемых клетками РЖ. Это значит, что результаты измерения концентрации РЖ-специфических ВНВ в биологических образцах, полученные с помощью разных аптамеров, будет являться не просто техническими «повторами» одного эксперимента, а результатами нескольких независимых экспериментов.

Рис. 2. Характеристика ДНК-аптамеров и AuNP-аптасенсоров. Визуализация предположительной вторичной структуры пяти выбранных аптамеров (А) и определение диапазона чувствительности AuNP-аптасенсоров на основе соответствующих аптамеров (Б): условный максимум фермент-миметической активности и, соответственно максимальная эффективность перекисного окисления ТМБ и абсорбции света 370 нм, наблюдались в случае взаимодействия наночастиц AuNP и субстрата (в отсутствии аптамеров и везикул), минимум фермент-миметической активности и, соответственно минимальная эффективность перекисного окисления ТМБ и абсорбции света 370 нм, наблюдались тогда, когда в реакционной смеси присутствовали аптамеры в концентрации, достаточной для полной инактивации AuNP (20 пмоль/мкл). Розовым цветом выделен диапазон показаний AuNP-аптасенсора при добавлении в реакционную смесь ВНВ десяти пациентов в концентрации от 5×10⁶ до 50×10⁶ частиц/мл.

Fig. 2. Characteristics of DNA aptamers and AuNP-aptasensors. Schematic representation of predicted secondary structure of DNA aptamers (A) and determination of the sensitivity range of AuNP-aptasensors based on the corresponding aptamers (B). The maximum values of enzyme-mimetic activity reflected by the maximum efficiency of TMB peroxidation and light absorption of 370 nm was observed after interaction of AuNP nanoparticles and substrate (TMB) without aptamers and vesicles, the minimum of enzyme-mimetic activity reflected by the minimum efficiency of TMB peroxidation and light absorption of 370 nm was observed in presence of aptamers in the reaction mixture at a concentration sufficient for complete inactivation of AuNP (20 pmol/µl). The AuNP-aptasensor’s analytic diapasons were essayed using SEV pool from ten patients added to the reaction mixture in concentrations from 5×10⁶ to 50×10⁶ particles/ml and indicated by pink color

С учетом структурных различий (длины, нуклеотидной последовательности, вторичной структуры) выбранных аптамеров, существовала возможность разницы их способности ингибировать фермент-миметическую активность наночастиц золота, что могло отразится на работе соответствующих AuNP-аптасенсоров. Для оценки функциональности AuNP-аптасенсоров на основе разных аптамеров, было проведено сравнительное исследование серии разведений смеси ВНВ десяти пациентов (от 5×10⁶ до 50×10⁶ частиц/мл). На рисунке 2Б представлены результаты: разные AuNP-аптасенсоры имели разные, но сопоставимые диапазоны аналитической чувствительности. Можно заметить, что аптамер с минимальной вторичной структурой (4а) обеспечивал максимальный диапазон фермент-миметической активности AuNP-аптасенсора, в то время как наличие протяженных комплементарных участков и вероятно жесткой вторичной структурой (Seq-3, Seq-6) приводило к сужению диапазона фермент-миметической (и, соответственно, аналитической) активности AuNP-аптасенсоров. Полученные данные позволяют ожидать сопоставимых аналитических характеристик AuNP-аптасенсоров, в состав которых входят выбранные аптамеры. Более глубокое исследование этого феномена требует проведения большего числа экспериментов и не являлось задачей данной работы.

Анализ тотальной популяции ВНВ с помощью аптасенсора. В основе нашего исследования лежала гипотеза о том, что (1) клетки дифференцированного РЖ секретируют ВНВ, мембрана которых «содержит» РЖ-специфические маркеры, которые должны аффинно взаимодействовать с соответствующими аптамерами, (2) повышение концентрации таких РЖ-специфических ВНВ может иметь диагностическое значение и может быть измерено с помощью AuNP-аптасенсора. Ранее, мы подтвердили аналогичную гипотезу относительно CD30(+)ВНВ в случае лимфомы Ходжкина, когда поверхностный маркер опухолевых клеток и секретируемых ими ВНВ был известен. В данном исследовании, нам не были известны конкретные молекулярные маркеры в составе РЖ-специфических ВНВ. Сравнительный анализ ВНВ, выделенных из биологических жидкостей пациентов с РЖ, был сделан с целью оценки наличия РЖ-специфических ВНВ и оценки применимости разработанной технологии для диагностики и/или динамического наблюдения за пациентами с РЖ.

Прорастание РЖ через слои кишечной стенки и развитие карциноматоза брюшины являются закономерными этапами развития заболевания, поэтому логичным казалось предположение о том, что эти процессы ассоциированы с появлением РЖ-специфичных ВНВ в перитонеальной полости. Смывы были сделаны в процессе диагностических лапароскопий у пациентов с гистологически верифицированным диагнозом РЖ, в качестве группы сравнения в исследование были включены пациенты с диагнозом хронический холециститом. На рисунке 3 представлены результаты анализа 15 образцов ВНВ от пациентов с РЖ и 8 контрольных образцов, демонстрирующие отсутствие разницы.

Рис. 3. Анализ ВНВ из перитонеальных смывов. Сравнение проведено между пациентами с РЖ и группой контролей (пациентами с острым холециститом). ВНВ были выделены из перитонеального смыва, анализ проведен с помощью AuNP-аптасенсоров с пятью разными ДНК-аптамерами. Интенсивность абсорбции измеряли на длине волны 370 нм. Используя критерий Манна ― Уитни, статистически значимое отличие между группами обнаружено не было

Fig. 3. Analysis of SEV from diagnostic peritoneal lavage liquid. Comparison was performed between gastric cancer patients and control group (patients with diseases of the biliary tract). SEVs were isolated from peritoneal lavage liquid, the analysis was carried out using AuNP-aptasensors with five different DNA aptamers. The absorption intensity was measured at a wavelength of 370 nm. No statistically significant difference was observed between the groups using the Mann ― Whitney test

Аналогичным образом был проведен анализ ВНВ, выделенных их плазмы пациентов с РЖ (n=21) и здоровых доноров (n=6) (рис. 4). Статистически значимая разница была обнаружена при использовании всех пяти аптамеров. Интересно, что наблюдалась разница в абсолютных значениях показателей, полученных с помощью разных аптамеров и эти данные коррелировали диапазонами аналитической активности AuNP-аптасенсоров (рис. 2Б): максимальные значения для аптамера 4a, минимальные ― Seq-3, Seq-6. Это наблюдение позволяет предположить, что абсолютные значения, полученные с помощью AuNP-аптасенсора, определяются характеристиками последнего, а разница между группами (пациенты с РЖ vs. доноры) ― особенностями маркеров, аффинно взаимодействующих с аптамерами.

Рис. 4. Анализ ВНВ из плазмы. Сравнение проведено между пациентами с РЖ и группой контроля (здоровых доноров). ВНВ выделены из плазмы, анализ проведен с помощью AuNP-аптасенсоров с пятью разными ДНК-аптамерами. Интенсивность абсорбции измеряли на длине волны 370 нм. Статистически значимое отличие между группами детектировали с использованием критерия Манна ― Уитни: *** (p<0.005), *****(p<0.00005)

Fig. 4. Analysis of plasma SEV. The comparison was carried out between gastric cancer patients and the control group (healthy donors). SEVs were isolated from plasma, the analysis was carried out using AuNP-aptasensors with five different DNA aptamers. The absorption intensity was measured at a wavelength of 370 nm. Statistically significant difference between the groups was evaluated using the Mann ― Whitney test: *** (p<0.005), *****(p<0.00005)

Оценка связи результатов анализа AuNP-аптасенсора и характеристик РЖ. Для сравнительной оценки результатов мы «нормализовали» данные пяти AuNP-апатасенсоров, работающих на основе разных аптамеров, путем расчета относительных показателей, выражающих результат как % от диапазона аналитической чувствительности каждого сенсора. Сравнение по рассчитанным относительным показателям проводили с использованием непараметрического критерия Краскела ― Уоллиса для трех групп, сформированных с учетом степени дифференцировки опухоли (рис. 5). Высокодифференцированный и умереннодифференцированный рак объединяли в одну группу: G1-2 (n=3), группа G3 включала низкодифференцированный рак (n=7), G4 ― недифференцированный рак (n=5).

Рис. 5. Оценка корреляции результатов анализа ВНВ и степени дифференцировки клеток РЖ. Сравнение между группами G1-2, G3 и G4 для образцов ВНВ, выделенных из плазмы и перитонеального смыва. Статистически значимое отличие определяли методом Краскела ― Уоллиса: *(p<0.05), **(p<0.005)

Fig. 5. Correlation of the results of SEV analysis and the degree of differentiation of gastric cancer cells. Comparison between groups G1-2, G3 and G4 of samples of SEVs isolated from plasma and peritoneal lavage fluid. Statistically significant difference was determined by the Kraskel ― Wallis method: *(p<0.05), **(p<0.005)

Для образцов ВНВ, полученных из плазмы, статистически значимое различие между группами отсутствовало. При сравнении образцов ВНВ, выделенных из перитонеальных смывов для аптамера Seq-3 разница между группами также не была обнаружена. Однако, для аптамеров 4a, PDGC21-T и Seq-19 было детектировано отличие между группами G1-2, G3 и G4 (p<0.05), а для аптамера Seq-6 разница была наиболее значимой (p<0.005). Интересно, что у троих пациентов с РЖ, в ходе цитологического исследования перитонеального смыва были обнаружены опухолевые клетки. Но эта клинически значимая особенность никак не отразилась на результатах анализа ВНВ в перитонеальных смывах этих пациентов.

Обсуждение

Возможности диагностики. В целом, полученные результаты продемонстрировали диагностический потенциал AuNP-аптасенсора в случае анализа плазмы: результаты, полученные с помощью пяти разных аптамеров, статистически значимо отличали группу пациентов с РЖ и здоровых доноров. Можно утверждать, что технология AuNP-аптасенсора является перспективной основой для создания тест-систем для ранней диагностики или скрининга РЖ. Активность аналогичных исследований, которые ведутся в различных лабораториях, косвенно подтверждает это утверждение. Кроме тех трех работ, результаты которых мы использовали в нашем исследовании и авторы которых не идентифицировали молекулярные маркеры клеток РЖ [21-23], в базе PubMed представлены интересные результаты детекции известных молекул (MMP2 [24], HER2 [25], MUC1 [26], CD63 [26]) с помощью аптамеров с целью диагностики РЖ. Сравнительный анализ современного состояния разработок в данной области недавно был сделан исследователями из университета Тегерана [27]. Сопоставив результаты двух десятков исследований, авторы сделали вывод: «By only using one marker, aptamer selection against exosomes is non-specific». В контексте этого заключения важно заметить, что принцип работы и экономичность технологии AuNP-аптасенсора предполагает возможность параллельного или одновременного использования нескольких аптамеров, аффинно взаимодействующих с разными маркерами в составе мембраны ВНВ. В недавнем исследовании на примере задачи детекции простат-специфических ВНВ мы показали, что использование нескольких разных аптамеров в составе AuNP-аптасенсора повышает эффективность анализа [28]. Таким образом, работа с целью создания нового метода диагностики РЖ должна предполагать решение следующих задач: (1) идентификацию РЖ-специфичных аптамеров, (2) поиск их наиболее «эффективных» сочетаний и (3) оценку диагностической значимости применения мульти-лигандного аптасенсора на больших коллекциях плазмы.

Возможности уточняющей диагностики и/или мониторинга эффекта терапии. Цитологический анализ жидкости перитонеального смыва является рутинной диагностической процедурой у пациентов с верифицированным РЖ, которая проводится с целью исключения перитонеальной диссеминации и принятия решения о радикальном комплексном лечении, поскольку позволяет обнаружить свободные опухолевые клетки в брюшной полости на микроскопическом уровне. В рамках нашего исследования мы использовали AuNP-аптасентор с целью анализа ВНВ, выделенных из жидкости перитонеального смыва. С целью предварительной оценки диагностического потенциала такого подхода, мы сравнили группу пациентов с РЖ и больных без онкологического диагноза, у которых смывы выполнялись во время лапароскопической холецистэктомии по поводу хронического калькулезного холецистита. Мы не увидели разницы между сравниваемыми группами. По причине инвазивности манипуляции, мы не могли использовать здоровых доноров в качестве группы контроля. Результат говорит о схожести молекулярного «профиля» мембраны ВНВ при двух заболеваниях, включенных в исследование, и/или о недостаточной специфичности использованных аптамеров. Это важный вывод, но он имеет ограниченное практическое значение, так как перитонеальный лаваж не является методом первичной или дифференциальной диагностики РЖ.

Больший интерес представляют результаты сравнения между собой групп пациентов с РЖ, разной степени дифференцировки ткани опухоли. Результаты этого сравнения оказались неожиданными: степень дифференцировки опухоли коррелирует с количеством детектируемых с помощью AuNP-аптасенсора «патологических» ВНВ в жидкости перитонеального смыва. С целью более наглядной иллюстрации этого наблюдения, мы упростили алгоритм интерпретации результатов: для каждого AuNP-аптасенсора было вычислено среднее для группы из пятнадцати анализируемых образцов (плазмa, n=15; перитонеальный смыв, n=15) значение, которое было использовано в качестве «cut off» для оценки отдельных результатов как «положительные» или «отрицательные». В таблице 2 представлены результаты, полученные с помощью такого алгоритма.

Таблица 2. «Бинарная» интерпретация результатов анализа с помощью AuNP-аптасенсора

Table 2. «Binary» interpretation of the analysis results using the AuNP-aptasensor

№

TNM

S4a

PDGC21-t

Seq-3

Seq-6

Seq-19

смыв

плазма

смыв

плазма

смыв

плазма

смыв

плазма

смыв

плазма

cT2N0M0

–

cT3N1M0

cT3N0M0

–

cT2N2M0

–

cT3N0M0

–

cT3N0M1

–

cT4aN2M1

–

cT3N2M0

cT3N0M0

–

cT2N2M0

–

cT3N1M0

–

cT4aN2M0

–

cT3N1M0

–

cT2N1M0

–

cT3N0M0

–

Далее, образцы были сгруппированы в соответствии со степенью дифференцировки опухоли (G1-2, G3, G4), и для каждой группы было подсчитано количество «положительных» результатов, полученных пятью разными AuNP-аптасенсорами. Результаты схематично представлены на рисунке 6, который демонстрирует отсутствие разницы при анализе плазмы и значимые отличия количества «позитивных» результатов между группами высоко-/умеренно- (G1-2), низкодифференцированных аденокарцином (G3) и группой недифференцированных опухолей (G4).

Рис. 6. Результаты «бинарной» интерпретации данных измерений, проведенных AuNP-аптасенсорами пятью разными аптамерами. Проведено сравнение групп образцов, полученных от пациентов с разной степенью дифференцировки РЖ (G1-2, G3, G4). На рисунке показан разброс относительного среднего значения для каждой группы (стандартное отклонение), с учетом характера формирования групп оценка статистической значимости разницы между ними не проводилась.

Fig. 6. The results of the «binary» interpretation of results obtained by AuNP-aptosensors with five different aptamers. A comparison of groups of samples obtained from patients with different degrees cancer tissue differentiation (G1-2, G3, G4) is demonstrated as well as standard deviation between patients in each of group. The statistical significance of the difference between groups was not evaluated

Представленная на рисунке 6 закономерность указывает на то, что ВНВ, секретируемые клетками недифференцированного РЖ детектируются чаще, то есть чувствительность такого анализа выше. На основе полученных данных нельзя определить, что является причиной этого феномена: более активная секреция ВНВ низкодифференцированными клетками или более выраженная представленность «маркерных» молекул на секретируемых клетками РЖ везикулах. Первый вариант представляется более вероятным, но аргументированное объяснение полученных результатов требует дополнительных исследований. На данном этапе, можно отметить практический потенциал применения AuNP-аптасенсора при анализе жидкости перитонеальных смывов. После дополнительной валидации полученных результатов на большей коллекции образцов и более детальным анализом клинико-морфологических данных, разработанная технология может стать полезным дополнением к стандартному цитологическому исследованию.

Заключение

Анализ ВНВ плазмы с помощью AuNP-аптасенсора является перспективной технология ранней диагностики РЖ. Оценка диагностической ценности разработанной технологии требует дальнейших исследований.
Результаты анализа ВНВ в составе перитонеальных смывов пациентов с верифицированным диагнозом РЖ коррелируют со степенью дифференцировки ткани опухоли. Применение разработанной технологии в рамках уточняющей диагностики пациентов с РЖ может иметь клинический смысл, но требует дополнительных более масштабных исследований.

Финансирование

Работа выполнена при финансовой поддержке Минздрава России в рамках Государственного Задания по теме «Разработка и клиническая апробация методов выделения, анализа и модификации состава циркулирующих нановезикул плазмы с целью персонализированного выбора и повышения эффективности стандартных режимов системной терапии онкологических заболеваний».

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Литература

Злокачественные новообразования в России в 2020 году (заболеваемость и смертность) / Под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, А.О. Шохзадовой. ― М.: МНИОИ им. П.А. Герцена ― филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, 2021. ― 252 с.
American Cancer Society Stomach Cancer Survival Rates.
Мерабишвили М.В. Выживаемость онкологических больных. Выпуск второй. Том I; Выпуск 2,.; Санкт-Петербург, 2011; ISBN 978-5-91258-176-2.
Lordick F., Carneiro F., Cascinu S., et al. Gastric cancer: ESMO Clinical Practice Guideline for diagnosis, treatment and follow-up // Ann. Oncol. ― 2022. ― 33. ― P. 1005-1020. doi: 10.1016/j.annonc.2022.07.004
Бесова Н.С., Трякин,А.А., Артамонова Е.В., и др. Практические рекомендации по лекарственному лечению рака желудка // Злокачественные опухоли. ― 2020. ― Т. 10, №3s2-1. ― С. 334-349. doi: 10.18027/2224-5057-2020-10-3s2-21
Zhang Z., Wu H., Chong W., et al. Liquid biopsy in gastric cancer: predictive and prognostic biomarkers // Cell Death Dis. ― 2022. ― 13. ― P. 903. doi: 10.1038/s41419-022-05350-2
Chen J., Li P., Zhang T., et al. Review on Strategies and Technologies for Exosome Isolation and Purification // Front. Bioeng. Biotechnol. ― 2022. ― Vol. 9. doi: 10.3389/fbioe.2021.811971
Li J., Li Y., Li P.; et al. Exosome detection via surface-enhanced Raman spectroscopy for cancer diagnosis // Acta Biomater. ― 2022. ― 144. ― P. 1-14. doi: 10.1016/j.actbio.2022.03.036
Zhu C., Li L., Wang Z., et al. Recent advances of aptasensors for exosomes detection // Biosens. Bioelectron. ― 2020. ― 160. ― P. 112213. doi: 10.1016/j.bios.2020.112213
Wu H., Fu M., Liu J., et al. The role and application of small extracellular vesicles in gastric cancer // Mol. Cancer. ― 2021. ― 20. ― P. 71. doi: 10.1186/s12943-021-01365-z
Skryabin G.O., Vinokurova S.V., Galetsky S.A., et al. Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Gastric Juice // Cancers (Basel). ― 2022. ― 14. ― P. 3314. doi: 10.3390/cancers14143314
Zhang C., Yang J., Chen Y., et al. miRNAs derived from plasma small extracellular vesicles predict organo-tropic metastasis of gastric cancer // Gastric Cancer. ― 2022. ― 25. ― P. 360-374. doi: 10.1007/s10120-021-01267-5
Zhu A., Shan Y., Zhang J., et al. Exosomal NNMT from peritoneum lavage fluid promotes peritoneal metastasis in gastric cancer // Kaohsiung J. Med. Sci. ― 2021. ― 37. ― P. 305-313. doi: 10.1002/kjm2.12334
Hu Y., Qi C., Liu X., et al. Malignant ascites-derived exosomes promote peritoneal tumor cell dissemination and reveal a distinct miRNA signature in advanced gastric cancer // Cancer Lett. ― 2019. ― 457. ― P. 142-150. doi: 10.1016/j.canlet.2019.04.034
Fu H., Yang H., Zhang X., et al. Exosomal TRIM3 is a novel marker and therapy target for gastric cancer // J. Exp. Clin. Cancer Res. ― 2018. ― 37. ― P. 162. doi: 10.1186/s13046-018-0825-0
Théry C., Amigorena S., Raposo G., Clayton A. Isolation and Characterization of Exosomes from Cell Culture Supernatants and Biological Fluids // Curr. Protoc. Cell Biol. ― 2006. doi: 10.1002/0471143030.cb0322s30
Slyusarenko M., Nikiforova N., Sidina E., et al. Formation and Evaluation of a Two-Phase Polymer System in Human Plasma as a Method for Extracellular Nanovesicle Isolation // Polymers (Basel). ― 2021. ― 13. ― P. 458. doi: 10.3390/polym13030458
Slyusarenko M., Shalaev S., Valitova A., et al. AuNP Aptasensor for Hodgkin Lymphoma Monitoring // Biosensors. ― 2022. ― 12. ― P. 23. doi: 10.3390/bios12010023
Piella J., Bastús N.G., Puntes,V. Size-Controlled Synthesis of Sub-10-nanometer Citrate-Stabilized Gold Nanoparticles and Related Optical Properties // Chem. Mater. ― 2016. ― 28. ― P. 1066-1075. doi: 10.1021/acs.chemmater.5b04406
Darmostuk M., Rimpelova S., Gbelcova H., Ruml T. Current approaches in SELEX: An update to aptamer selection technology // Biotechnol. Adv. ― 2014. ― 33.
Li K., Qi L., Gao L., et al. Selection and preliminary application of a single stranded DNA aptamer targeting colorectal cancer serum // RSC Adv. ― 2019. ― 9. ― P. 38867-38876. doi: 10.1039/C9RA04777H
Ding F., Guo S., Xie M., et al. Diagnostic applications of gastric carcinoma cell aptamers in vitro and in vivo // Talanta. ― 2015. ― 134. ― P. 30-36. doi: 10.1016/j.talanta.2014.09.036
Zheng Y., Zhao Y., Di Y., et al. DNA aptamers from whole-serum SELEX as new diagnostic agents against gastric cancer // RSC Adv. ― 2019. ― 9. ― P. 950-957. doi: 10.1039/C8RA08642G
Han M.-E., Baek S., Kim H.-J., et al. Development of an aptamer-conjugated fluorescent nanoprobe for MMP2 // Nanoscale Res. Lett. ― 2014. ― 9. ― P. 104. doi: 10.1186/1556-276X-9-104
Sett A., Borthakur B.B., Bora U. Selection of DNA aptamers for extra cellular domain of human epidermal growth factor receptor 2 to detect HER2 positive carcinomas // Clin. Transl. Oncol. ― 2017. ― 19. ― P. 976-988. doi: 10.1007/s12094-017-1629-y
Huang R., He L., Li S., et al. A simple fluorescence aptasensor for gastric cancer exosome detection based on branched rolling circle amplification // Nanoscale. ― 2020. ― 12. ― P. 2445-2451. doi: 10.1039/C9NR08747H
Rajabi R., Afrashteh F., Maddah F. Application of Aptamer-based Biosensors in Early Diagnosis of Gastric Cancer: A Promising Method for Early Detection // Explor. Res. Hypothesis Med. ― 2023. doi: 10.14218/ERHM.2022.00125
Zabegina L., Zyatchin I., Kniazeva M., et al. Diagnosis of Prostate Cancer through the Multi-Ligand Binding of Prostate-Derived Extracellular Vesicles and miRNA Analysis // Life. ― 2023. ― 13. ― P. 885. doi: 10.3390/life13040885