ИММУННЫЕ КЛЕТКИ МИКРООКРУЖЕНИЯ РАКА ЯИЧНИКОВ

от
Print Friendly, PDF & EmailРаспечатать / Сохранить в PDF

© В.Н. Журман, 2023

УДК 618.11-006.6-036.1

 В.Н. Журман1,2

1ГБУЗ «Приморский краевой онкологический диспансер», г. Владивосток

2ФГБОУ ВО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» МЗ РФ, г. Владивосток

Журман Варвара Николаевна — кандидат медицинских наук, врач онколог ГБУЗ «Приморский краевой онкологический диспансер»

690105, г. Владивосток, ул. Русская, д. 63А, тел. +7-904-622-25-77, e-mail: varvara2007@yandex.ru, ORCID ID: 0000-0002-6927-3336

Реферат. Злокачественные новообразования яичников эпителиальной природы составляют 90%, из них на долю серозных карцином приходится до 85%. В силу выраженной гетерогенности (на молекулярном и генетическом уровне) и химиорезистентности, возникают трудности в поиске активных мишеней, для элиминации опухоли. Проведено иммуногистохимическое исследование опухолевого материала у 74 больных серозным раком яичников, получавших лечение в период с 2016 по 2021 гг. Для определения антигенов в образцах использовали моноклональные антитела: CD3, CD4, CD8, CD11b, CD14 и CD16. Средний возраст больных составил 57±11 лет. В сравнительную группу вошли 70 пациенток с доброкачественными образованиями яичников. Полученные результаты иммуногистохимического исследования показали, что в составе иммунных клеток микроокружения наибольшее количество клеток, на всех стадиях (I–IV) онкологического процесса, представлено макрофагами (СD11b+, CD14+), на втором месте по количеству клеток СD3+ лимфоциты, затем СD8+ и СD4+ и самое малое количество CD16+ клеток.

В результате проведения иммуногистохимического исследования обнаружена разнонаправленная тенденция между популяционным составом опухоль-ассоциированных иммунных клеток микроокружения и стадией серозного рака яичника. С увеличением стадии заболевания количество макрофагов (СD11b+, CD14+) и лимфоцитов (СD3+, CD16+) уменьшалось не зависимо от степени дифференцировки опухоли. С увеличением стадии опухоли уменьшалось количество популяций СD4+ и СD8+, но в данном случае немало важную роль играла степень дифференцировки, чем выше стадия опухоли и ниже степень дифференцировки, тем меньше клеток обнаружено.

Ключевые слова: серозный рак яичников low-grade, high-grade, моноклональные антитела: CD3, CD4, CD8, CD11b, CD14 и CD16.

 

 

 

Введение

В России рак яичников занимает первое место в структуре смертности от злокачественных новообразований женских половых органов [1]. Злокачественные новообразования яичников эпителиальной природы составляют 90%, из них на долю серозных карцином приходится до 85% [2-4]. Учитывая выраженную гетерогенность и химиорезистентность опухоли, возникают трудности в поиске активных мишеней, для элиминации опухоли.

В микроокружении под влиянием опухоли иммунный профиль подвергается значительному «редактированию». Образуется иммуносупрессивная сеть, подавляющая активность основного эффектора клеточного иммунитета Т-лимфоцитов. В микроокружении Т-клетки находятся в состоянии анергии, характеризующимся повышенной экспрессией рецепторов, ингибирующих активность опухолевых клеток, снижением секреции цитокинов и цитолитической активности, что затрудняет апоптоз опухолевых клеток [5]. Цитотоксические CD8+ Т-клетки памяти способны ликвидировать опухолевые клетки, стимулируя иммунный ответ. CD8+ T-клетки в микроокружении поддерживаются CD4 + T-хелперами 1 (TH1), которые выделяют интерферон-гамма (ИНФγ) и интерлейкин-2 (ИЛ-2) [6]. Другая CD4+ популяция клеток, T-хелперами 2 (TH2), поддерживают ответ В-клеток за счет продукции ИЛ-4, ИЛ-5 и ИЛ-13 [7].

Макрофаги, связаны с ростом, ангиогенезом и метастазированием при различных видах рака, накапливаются в микроокружении через поляризацию TRM (Resident Memory T cells ― тканево-резидентные Т-клетки памяти), М1- на альтернативный М2-фенотип. Провоспалительные цитокины продуцируются макрофагами с фенотипом М1, макрофаги с фенотипом М2, продуцируют несколько факторов роста, участвующих в ремоделировании тканей. Увеличение числа М2-клеток в микроокружении коррелирует с неблагоприятным прогнозом. Опухоль-ассоциированные макрофаги подавляют дифференцировку лимфоцитов в микроокружении, секретируют ингибиторные цитокины ИЛ-10 и трансформирующие факторы роста (TGF-β) и способствуют переходу Т-клеток в регуляторные Treg-клетки [8, 9]. Клетки опухоли, продуцирующие VEGF, CCL2, M-CSF и ангиопоэтин 2, способствуют переходу моноцитов из кровотока в микроокружение и дифференцируются в опухоль-ассоциированные макрофаги [9]. Сверхэкспрессия CCL2 клетками фиброкарциномы приводит к рекрутированию опухоль-ассоциированных макрофагов и способствует канцерогенезу. У больных раком яичников опухоль-ассоциированные макрофаги в микроокружении характеризуются повышенной экспрессией маркеров CD68 и CD163, которые принимают участие в ремоделировании внеклеточного матрикса и поддерживают сосудистую проходимость, способствуя инвазии и прогрессированию опухолевого процесса. Наличие опухоли с высокой инфильтрацией опухоль-ассоциированных макрофагов коррелирует с неблагоприятным прогнозом и неэффективностью терапии. Истощение опухоль-ассоциированных макрофагов считается перспективным методом иммунотерапии. На сегодняшний день обсуждаются факторы, ответственных за хоминг макрофагов в опухолях, механизмы преобразования опухоль-ассоциированных макрофагов M1 в M2, способы воздействия на функции M2 опухоль-ассоциированные макрофаги [8]. Мезенхимальные стволовые клетки в микроокружении, способны подавлять функции иммунных эффекторных клеток и оказывать потенцирующее действие на активность регуляторных иммунных клеток. В прогрессировании заболевания решающую роль выполняют мезенхимальные стволовые клетки, обеспечивая основу для хоминга опухолевых клеток в форме опухолевой стромы и секретируют факторы благоприятно влияющие на рост опухоли. Мезенхимальные стволовые клетки, дифференцируются в макрофаги 2 типа (М2) и в миелоид-зависимые супрессорные клетки (MDSC ― myeloid-derived suppressor cells) под влиянием цитокинов и хемокинов [10, 11]. Рекрутирование мезенхимальных стволовых клеток опухолью и их перепрограммирование приводит к патологическим изменениям фенотипа и функции, потенцируя опухолевый процесс и взаимодействуя с разными типами клеток. Мезенхимальные стволовые клетки обеспечивают рост опухоли с помощью множества факторов, способствующих прогрессированию.

Миеломоноциты, превращающиеся в моноциты/макрофаги и гранулоциты в процессе созревания, приобретают различные кластеры дифференцировки (CD). Наиболее значимыми являются CD11b и CD14, на данный момент их роль в микроокружении рака яичников мало изучена.

Трансмембранный гликопротеин I типа ― CD11b, являющийся рецептором для С3bi-компонента комплемента. Антигена CD18 способствует экспрессии рецептора CD11b на поверхности клетки. Вместе эти две субъединицы образуют интегрин CD11b/CD18, один из четырех гетеродимеров интегрина, образованных путем соединения β-цепи CD18 с четырьмя характерными      α-цепями CD11. Интегрин       CD11b/CD18 экспрессируется на поверхности NK-клеток, нейтрофилов, моноцитов и макрофагов.

Одноцепочечный мембранный гликозилфосфатидилинозитол-связанный белок ― CD14, экспрессируется на поверхности клеток миелоидного ряда, связывается с фосфоинозитолом и является рецептором для липополисахарида. Также этот маркер ассоциируется с клеточными элементами моноцитарной линии на поздних этапах дифференцировки (промоноциты, моноциты, гистиоциты/макрофаги).

Естественные киллеры (NK) и врожденные естественные киллеры T (NKT) клетки экспрессируют ингибирующие, адгезивные, активирующие и цитокиновые рецепторы для идентификации клеточных мишеней и сохранения здоровых клеток. Сигналы, поступающие от этих рецепторов при контакте с клетками микроокружения, запускают активацию естественных киллеров. Также NK- и NKT-клетки обнаруживают патологические внутренние изменения в опухолевом микроокружении и активируют механизмы противоопухолевого иммунитета [12, 13]. NK-клетки микроокружения изменяют свой фенотип, снижая экспрессию рецепторов, запускающих противоопухолевую защиту. При изменении фенотипа NK-клетки, находящиеся в микроокружении, утрачивают способность активировать дегрануляцию и продукцию ИНФ-γ. Опухолевые клетки экспрессируют лиганды для активирующих и для ингибирующих рецепторов NK-клеток [13]. Микроокружение опухоли локально повреждает NK-клетки, и способствует прогрессированию опухоли.

Опухолевые клетки экспрессируют молекулы и высвобождают медиаторы, которые позволяют им уклоняться от иммунного надзора NK-клеток. На опухолевых клетках присутствуют высокие уровни неклассических молекул MHC I класса, HLA-E и HLA-G, которые являются ингибирующими лигандами для CD94/NKG2A и ILT2. Опухолевые клетки негативно регулируют функцию NK-клеток за счет высвобождения иммуносупрессивных факторов IL-10 или TGF-β [14].

 Материал и методы

Исследование выполнено в ФГБОУ ВО ТГМУ Минздрава России на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории. Материал взят в ГБУЗ «Приморский краевой онкологический диспансер». Проведено иммуногистохимическое исследование опухолевого материала у 74 больных серозным раком яичников, получавших лечение в период с 2016 по 2021 гг. Для определения антигенов в образцах использовали моноклональные антитела: CD3, CD4, CD8, CD11b, CD14 и CD16. Средний возраст больных составил 57±11 лет. В сравнительную группу вошли 70 пациенток с доброкачественными образованиями яичников. Их средний возраст 54±13 лет. Полученные значения были подвергнуты математической и статистической обработке в программе Microsoft Exсel 2016 и STATISTICA 13.0 (StatSoft Inc., США). Изучение препаратов проводили под микроскопом Olympus CX41, оснащенном цифровой камерой UTV0.35XC-2 (Olympus, Япония). Морфометрическую обработку полученных изображений осуществляли с помощью программы NIS-Elements BR (Nikon, Япония). Для чего с одного препарата произведена выборка из 10 фотографий при 10-кратном увеличении объектива, сделанных с разных полей зрения. Во всех полях зрения производился расчет позитивной реакции площади бинара препарата и высчитывалось среднее значение позитивного окрашивания.

 Результаты

Из 74 больных серозным раком яичников на долю больных с первой стадией пришлось 11,2%, со второй стадией ― 8,0%, с третьей стадией ― 43,5% и c четвертой стадией ― 37,1% больных (рис. 1а). По типу серозного рака ― low-grade серозный рак составил 32,3%, high-grade серозный рак составил 67,7% (рис. 1б). Средний возраст больных составил 57±12 лет.

Рис. 1. Распределение пациентов с серозным раком яичников по стадиям опухолевого процесса (а), степеням дифференцировки опухолевых клеток (б)

Fig. 1. Distribution of patients with serous ovarian cancer by stages of the tumor process (a), degrees of differentiation of tumor cells (b)

Иммунные клетки присутствуют в образцах доброкачественных образованиях яичников, но на более низком уровне. При сравнении экспрессии маркеров (СD3, СD16) при доброкачественной опухоли (группа контроля) и при каждой стадии серозного рака яичников достоверность различий по критерию Манна ― Уитни значимы при p≤0,01 (рис. 2, 3).

Рис. 2. Экспрессия СD3 антигенов клеточной поверхности Т-лимфоцитов в микроокружении серозного рака яичников, х200

Fig. 2. Expression of CD3 antigens of the cell surface of T-lymphocytes in the microenvironment of serous ovarian cancer, x200

Рис. 3. Экспрессия СD3 антигенов клеточной поверхности Т-лимфоцитов в ткани доброкачественной опухоли яичников, х200

Fig. 3. Expression of CD3 antigens of the cell surface of T-lymphocytes in the tissue of a benign ovarian tumor, x200

Исследуя СD3+ лимфоциты, определили, что на I стадии опухолевого процесса количество клеток было максимальным 965,0 (942,5; 981,0) (табл. 1).

При серозном раке яичников II–III стадии выявляли тенденцию к уменьшению экспрессии СD3+ в микроокружении опухоли (табл. 1). При IV стадии выявлено наименьшее количество клеток СD3+ 356,0 (335,0; 373,0), соответственно, что подтверждает тенденцию к уменьшению их количества в зависимости от прогрессирования опухолевого процесса.

Таблица 1. Медиана экспрессии рецепторов CD3+ клеток микроокружения опухоли у больных серозным раком яичников

Table 1. Median expression of CD3+ receptors of tumor microenvironment cells in patients with serous ovarian cancer

Стадия CD3, медиана (нижний; верхний квартиль)
I 965,0 (942,5; 981,0)
II 742,0 (735,0; 754,0)
III 350,0 (528,0; 566,0)
IV 356,0 (335,0; 373,0)

Вероятно, такое уменьшение СD3+клеток связано с влиянием опухолевых клеток на изменение фенотипа Т-лимфоцитов посредством их истощения и подавления функциональной активности.

СD16+ лимфоциты имеют тенденцию к уменьшению в микроокружении опухоли в зависимости от распространенности опухолевого процесса (рис. 4, 5).

Рис. 4. Экспрессия СD16+ антигенов клеточной поверхности Т-лимфоцитов в микроокружении серозного рака яичников, х200

Fig. 4. Expression of CD16+ antigens of the cell surface of T-lymphocytes in the microenvironment of serous ovarian cancer, x200

Рис. 5. Экспрессия СD16+ антигенов клеточной поверхности Т-лимфоцитов в ткани доброкачественной опухоли яичников, х200

Fig. 5. Expression of CD16+ antigens of the cell surface of T-lymphocytes in the tissue of a benign ovarian tumor, x200

Количество СD16+ клеток в сравнении с другими популяциями лимфоцитов было минимальным на всех стадиях опухолевого заболевания (табл. 2).

Таблица 2. Значения экспрессии рецептора CD16+ клеток микроокружения опухоли у больных серозным раком яичников

Table 2. Values of CD16+ receptor expression of tumor microenvironment cells in patients with serous ovarian cancer

Стадия CD16, медиана (нижний; верхний квартиль)
I 84,0 (79,5; 96,5)
II 59,0 (59,0; 61,0)
III 47,0 (43,5; 50,5)
IV 34,0 (26,0; 37,5)

При анализе количества СD3+, CD16+ клеток и стадии рака серозного яичников low-grade и high-grade выявили, что статистически значимых различий между результатами групп нет (табл. 3).

Таблица 3. Значения рецепторов CD3+ и CD16+ клеток микроокружения опухоли у больных раком яичников

Table 3. Values of CD3+ and CD16+ receptors of tumor microenvironment cells in patients with ovarian cancer

Дифференцировка серозного рака

яичников

 CD3, медиана (нижний; верхний квартиль) CD16, медиана (нижний; верхний квартиль)
Low-grade 535,5 (432,5; 569,25) 51,5 (41,7; 54,5)
High-grade 532,0 (370,5; 571,5) 41,0 (34,2; 44,7)

Иммунные клетки СD4+, СD8+ присутствуют в образцах доброкачественных образований яичников, но на более низком уровне (рис. 6-8).

Рис. 6. Экспрессия СD4+ антигенов клеточной поверхности Т-лимфоцитов в ткани доброкачественных образований яичников, х200

Fig. 6. Expression of CD4+ antigens of the cell surface of T-lymphocytes in the tissue of benign ovarian formations, x200

Рис. 7. Экспрессия СD8+ антигенов клеточной поверхности Т-лимфоцитов в микроокружении рака яичников, х200

Fig. 7. Expression of CD8+ antigens of the cell surface of T-lymphocytes in the microenvironment of ovarian cancer, x200

Рис. 8. Экспрессия СD8+ антигенов клеточной поверхности Т-лимфоцитов в ткани доброкачественных образований яичников, х200

Fig. 8. Expression of CD8+ antigens of the cell surface of T-lymphocytes in the tissue of benign ovarian formations, x200

Также анализ полученных данных позволил установить, что гиперэкспрессия СD4+ и СD8+ клеток в микроокружении опухоли встречается чаще у больных серозным раком яичников low-grade, чем у больных с серозном раком яичников high-grade (табл. 4).

Таблица 4. Значения экспрессии рецепторов CD4+ и CD8+ клеток микроокружения опухоли у больных серозным раком яичников

Table 4. Expression values of CD4+ and CD8+ receptors of tumor microenvironment cells in patients with serous ovarian cancer

Дифференцировка

серозного рака яичников

 CD4, медиана (нижний; верхний квартиль) CD8, медиана (нижний; верхний квартиль)
Low-grade 443,5 (426,5; 455,7) 440,5 (422,0; 453,0)
High-grade 109,0 (91,2; 117,7) 104,0 (84,5; 112,7)

Прослеживается тенденция уменьшения количества данных иммунных клеток с распространенностью процесса и это подтверждается научными исследованиями последних лет. Многие статьи подтверждают, что эффекторные Т-лимфоциты утрачивают способность распознавать опухолевые клетки из-за слабой экспрессии, презентации или мутации опухолевых антигенов. В частности, опухолевые клетки утрачивают экспрессию одного или нескольких типов молекул MHC I класса необходимых для распознавания опухолевых антигенов CD8+ Т-лимфоцитами. Опухолевые клетки не экспрессируют молекулы CD80+ и CD86+, распознаваемые ко-рецептором CD28+ на поверхности CD8+ Т-лимфоцитов. Без сигнала, поступающего с ко-рецептора, во время презентации опухолевого антигена CD8+ Т-лимфоцитам происходит не активация, а полная утрата ими способности как воспринимать, так и реагировать на любые сигналы извне (анергия). Опухолевые клетки продуцируют иммуносупрессорные факторы, которые действуют на подавление активации и дифференцировки эффекторных Т-лимфоцитов, угнетают их созревание и функции антигенпрезентирующих клеток.

Рецепторный фенотип макрофагов в микроокружении серозного рака яичников CD11b и CD14 также экспрессируется в образцах доброкачественных образований яичников, но на более низком уровне (рис. 9-12). При сравнении экспрессии CD11b+ и CD14+ при доброкачественной опухоли и при каждой стадии серозного рака яичников.

Количество макрофагов, в сравнении с другими популяциями иммунных клеток, было самое максимальное на всех стадиях опухолевого процесса (табл. 5).

 Таблица 5. Значения экспрессии рецепторов CD11b+ и CD14+ клеток микроокружения у больных серозным раком яичников

Table 5. Expression values of CD11b+ and CD14+ receptors of microenvironment cells in patients with serous ovarian cancer

Стадия CD11b, медиана (нижний; верхний квартиль) CD14, медиана (нижний; верхний квартиль)
I 1115,0 (971,5; 1152,5) 569,0 (557,0; 575,5)
II 772,0 (769,0; 821,0) 478,0 (475,0; 482,0)
III 450,0 (359,0; 505,0) 349,0 (322,5; 365,5)
IV 245,0 (188,5; 279,0) 254,0 (237,5; 270,5)

Сравнивая количество CD11b+ и CD14+ клеток у больных серозным раком яичников low-grade и high-grade статистически значимых различий не выявлено.

 Заключение

Полученные результаты иммуногистохимического исследования показали, что в составе иммунных клеток микроокружения наибольшее количество клеток, при всех стадиях (I–IV) онкологического процесса, представлено макрофагами ― СD11b+, CD14+, на втором месте по количеству клеток СD3+ лимфоциты, затем СD8+ и СD4+ и самое малое количество CD16+ клеток.

С увеличением стадии заболевания серозного рака яичников количество макрофагов (СD11b+, CD14+) и лимфоцитов (СD3+, CD16+) уменьшалось не зависимо от степени дифференцировки. С увеличением стадии опухоли уменьшалось количество популяций СD4+ и СD8+ клеток микроокружения, но в данном случае имела значение степень дифференцировки опухоли, то есть при IV стадии серозного рака яичников low-grade, обнаружено меньше всего СD4+ и СD8+ клеток микроокружения.

Полученные данные позволяют нам сделать вывод, что клетки серозного рака яичников влияют на количественный состав иммунных клеток в микроокружении, блокируют клеточные рецепторы, тем самым уменьшают активность противоопухолевого иммунитета и позволяет нам в дальнейшем исследовать субпопуляции лимфоцитов и макрофагов в микроокружении, находить те звенья иммунитета, которые больше всего «порабощаются» опухолью с целью подбора более эффективной терапии в отношении серозного рака яичников.

Конфликт интересов

Автор декларирует отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования

Автор заявляет о финансировании проведенного исследования из собственных средств.

 Литература

  1. Ефимова О.А., Сафонова М.А. Эпидемиология рака яичников на ранних стадиях // Клиническая и профилактическая медицина. ― 2018. ― №4. ― С. 9-18.
  2. Давыдова И.Ю., Кузнецов В.В., Карселадзе А.И. Серозные пограничные опухоли яичников (клиническое течение, морфология, лечение) // Гинекология. ― 2012. ― №3-4. ― С. 165-168.
  3. Солопова А.Е., Чащин А.А., Солопова А.Г., Макацария А.Д. Современные взгляды на патогенез и возможности диагностики эпителиального рака яичников // Акушерство • Гинекология • Репродукция. ― 2016. ― Т. 10, №1. ― С. 75-83.
  4. Солопова А.Е., Чащин А.А., Солопова А.Г., Макацария А.Д. Эпителиальный рак яичников. Клиническая лекция // Акушерство • Гинекология • Репродукция. ― 2016. ― Т. 10, №3. ― С. 53-65.
  5. Халикова Л.В. Количественное гистологическое исследование реакции иммунной системы на рак яичников и его прогностическое значение // Креативная хирургия и онкология. ― 2014. ― №4. ― С. 49-52.
  6. Roma-Rodrigues C., Mendes , Pedro V. Baptista, Fernandes A.R. Targeting Tumor Microenvironment for Cancer Therapy // Int. J. Mol. Sci. ― 2019. ― Feb. ― 20 (4). ― P. 840. doi: 10.3390/ijms20040840
  7. Hinshaw D.C., Shevde L.A., The Tumor Microenvironment Innately Modulates Cancer Progression // Cancer Res. ― 2019. ― Sep 15. ― 79 (18). ― P. 45574566. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-18-3962. Epub 2019 Jul 26
  8. Mhawech-Fauceglia P., Wang D., Ali L., et al. Intraepithelial T cells and tumor-associated macrophages in ovarian cancer patients // Cancer Immun. ― 2013. ― 13. ― 1. Epub 2013 Jan 15.
  9. Vitale I., Manic G., Coussens L.M., et al. Macrophages and Metabolism in the Tumor Microenvironment // Cell Metab. ― 2019. ― Jul 2. ― 30 (1). ― P. 36-50. doi: 10.1016/j.cmet.2019.06.001
  10. Богданова И.М., Болтовская М.Н., Рахмилевич А.Л., Артемьева К.A. Ключевая роль опухоль-ассоциированных макрофагов в прогрессировании и метастазировании опухолей // Иммунология. ― 2019. ― Т. 40, №4. ― С. 41-47.
  11. Zhou K., Cheng T., Zhan J., et al. Targeting tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment // Oncol. Lett. ― 2020. ― Nov. ― 20 (5). ― P. 234. doi: 10.3892/ol.2020.12097. Epub 2020 Sep 14
  12. Златник Е.Ю., Неродо Г.А., Арджа А.Ю., и др. Роль иммунологической памяти в формировании противоопухолевого иммунитета у больных раком яичников на этапе неоадъювантного лечения // Вестник РГМУ. ― ― 5. ― С. 63-73.
  13. Terrén I., Orrantia A., Joana Vitallé J., et al. NK Cell Metabolism and Tumor Microenvironment // Front Immunol. ― 2019. ― Sep 24. ― 10. ― 2278. doi: 10.3389/fimmu.2019.02278. eCollection 2019
  14. Коцюрбий Е.А., Тихонов Я.Н., Назарова И.В., и др. Практическое использование метода клеточных блоков для диагностики новообразований поджелудочной железы и опухолевых процессов других локализаций // Тихоокеанский медицинский журнал. ― ― 4. ― С. 90-92. https://doi.org/10.34215/1609-1175-2020-4-90-92