ВЛИЯНИЕ ХРОНИЧЕСКОЙ БОЛИ НА НЕКОТОРЫЕ МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В ТКАНИ МЕЛАНОМЫ В16/F10 У САМОК МЫШЕЙ

УДК 616.5-006.81-06-085:615.35

Е.М. Франциянц, И.М. Котиева, В.А. Бандовкина, Е.И. Сурикова, И.В. Каплиева, И.В. Нескубина, Н.Д. Черярина

ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России, г. Ростов-на-Дону

Сурикова Екатерина Игоревна ― кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории изучения патогенеза злокачественных опухолей ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России

344037, г. Ростов-на-Дону, 14 линия, д. 63, тел.: (863) 200-10-00 доб. 482 или -483, +7-904-501-83-62, e-mail: sunsur2000@mail.ru

Реферат. Несмотря на значительный прогресс в понимании нейрофизиологии и психологии боли, фундаментальные и клинические аспекты проблемы хронической боли остаются во многом нерешенными. Развитие опухоли и хроническая боль являются выраженными стрессорными факторами, в механизмах которых участвуют многие факторы роста, гормоны, нейромедиаторы.

Цель исследования ― изучить механизмы формирования условий стимуляции роста опухоли и активации ангиогенеза под влиянием хронической нейропатической боли (ХНБ).

Материал и методы. Работа выполнена на 56 самках мышей линии С57BL/6. Животным основной группы меланому В16/F10 перевивали через 2 недели после двусторонней перевязки седалищных нервов, в группе сравнения ― только перевивка меланомы. В коже (животные интактные и с ХНБ) и в ткани опухоли (группа сравнения и основная) методами ИФА и РИА определяли концентрации VEGF (А и С) и растворимых форм их рецепторов (R1 и R3), половых гормонов, их рецепторов и пролактина, биогенных аминов, компонентов NO-системы. Статистическую обработку результатов проводили программой Statistica 6,0, значимость различий оценивали с помощью t-критерия Стьюдента и критерия Манна ― Уитни. Различия считали значимыми при p<0,05.

Результаты. В основной группе выявлено снижение средней продолжительности жизни мышей, более раннее появление метастазов, в том числе и в нетипичные зоны. При этом в опухоли обнаружено увеличение концентрации VEGF-A и VEGF-C, NOS-3, NOS-2, цитруллина и АДМА. Выявлено увеличение концентрации эстрона, прогестерона, пролактина и рецепторов к эстрогенам, андрогенам и прогестерону. Отмечено изменение баланса биогенных аминов: увеличение содержания адреналина и серотонина и снижение норадреналина и дофамина.

Заключение. Представленные результаты могут являться подтверждением системного влияния ХНБ, под воздействием которой значительно изменяется функционирование вазоактивной NO- и нейрогуморальной систем, приводя к формированию условий активации ангиогенеза и роста опухоли.

Ключевые слова: мыши, меланома B16/F10, хроническая боль, патогенез опухолевого роста, ангиогенез, кожа, опухоль, половые гормоны, биогенные амины, оксид азота

Введение

В настоящее время в медицине сформировалось новое направление ― медицина боли. Наряду с этим приходится признать, что в нашей стране наблюдается значительное отставание как в активности научных исследований, так и в медицинской помощи больным с различными болевыми синдромами. Несмотря на значительный прогресс в понимании нейрофизиологии и психологии боли, фундаментальные и клинические аспекты проблемы хронической боли остаются во многом нерешенными [1]. Учитывая, что в настоящее время методы лечения хронической нейропатической боли (ХНБ) являются неудовлетворительными, исследование механизмов, с помощью которых повреждение нерва вызывает боль, остается в центре внимания исследований [2]. Основные механизмы ХНБ плохо изучены, что усложняет управление ею. Высокая распространенность хронических болевых синдромов, их тяжелое гуманитарное и социально-экономическое бремя вызвало значительную активизацию фундаментальных и клинических исследований [1]. Одним из результатов исследований механизмов боли и патогенетически обоснованных подходов к ее терапии стало понимание, того что болевое воздействие, сопровождающее патологические процессы в живом организме, способно вызывать значительные изменения показателей гомеостаза.

Было высказано обоснованное утверждение о том, что отсутствие экспериментальных работ на грызунах, представляющих аналог модели человеческой боли, способствует плохому пониманию основных результатов исследования боли [3].

В настоящее время создано достаточно много экспериментальных моделей, в которых боль возникает на фоне роста злокачественных опухолей или под влиянием химиотерапии. С другой стороны, нередко ХНБ возникает задолго до появления рака.

Целью исследования явилось изучение механизмов формирования условий стимуляции роста меланомы В16/F10 и активации ангиогенеза у самок мышей под влиянием хронической нейропатической боли (ХНБ).

Материал и методы

Работа выполнена на самках мышей линии С57ВL/6 (n=56), 8 недельного возраста с начальной массой 21-22 г. Животные были получены из ФГБУН Научный центр биомедицинских технологий «Андреевка» ФМБА (Московская область). В работе использовали клеточную линию мышиной, метастазирующей в легкие меланомы В16/F10, полученную из РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН (г. Москва). Животные содержались при естественном режиме освещения со свободным доступом к воде и пище. Протокол исследования был одобрен Комиссией по биоэтике ФГБУ «РНИОИ» МЗ РФ.

Все самки находились в состоянии диэструса. Животные были распределены на группы: интактные мыши (n=14), контрольная группа ― воспроизведение модели ХНБ (n=14), группа сравнения ― меланома В16/F10 (n=14) и основная ― мыши с меланомой В16/F10, воспроизведенной на фоне ХНБ (n=14).

Все манипуляции с животными производили в боксе. Каждому животному контрольной и основной групп вводили ксила-золетиловый наркоз: за 10 минут до основного наркоза с целью премедикации животному внутримышечно вводили ксилазин (препарат Ксила) в дозе 0,05 мл/кг массы тела (по инструкции), затем ― Золетил-50 в дозе 10 мг/100 г массы тела. Мышам основной группы осуществляли перевязку седалищного нерва с 2-х сторон. Через 2 недели после заживления операционной раны мышам основной группы перевивали меланому В16/F10. Животным группы сравнения только перевивали меланому В16/F10 [4].

Через 3 недели после перевивки опухоли мышей всех групп быстро декапитировали. Опухоль выделяли сразу после декапитации. Из ткани получали 10% цитозольные фракции, приготовленные на 0,1М калий-фосфатном буфере рН 7.4, содержащем 0,1% Твин-20 и 1% БСА, в которых с помощью стандартных тест-систем ИФА определяли: свободную форму тестостерона (ХЕМА, Россия); эстрон (DBC, Канада); VEGF-А, VEGFR-1, VEGF-С, sVEGFR-3 (Bender Med Systems, США); гистамин, адреналин, норадреналин, дофамин, серотонин, 5-оксииндолуксусной кислоту (5-ОИУК) (Cusabio, Китай); уровень рецепторов эстрогенов ― ERα и ERβ, андрогенов ― RА и прогестерона ― RР4 (CUSABIO BIOTECH Co., Ltd., Китай); NOS-2, NOS-3 (Cloud-Clone Corp., США); L-аргинин, L-цитруллин, асимметричный диметиларгинин АДМА (Immundiagnostik, Германия); общий нитрит (R&D systems, США) и нитротирозин (Hycult Biotech, Нидерланды). Радиоиммунным методом определяли уровень эстрадиола, общего тестостерона, прогестерона и пролактина (стандартные тест-наборы фирмы Иммунотех, Чехия; анализатор «Ариан», Россия).

Статистическая обработка результатов проводилась с помощью программы Statistica 6,0. Данные представлены в виде среднего значения±стандартная ошибка. Часть показателей имела распределение, соответствующее нормальному, часть ― отличающееся от нормального, поэтому значимость различий оценивали с помощью t-критерия Стьюдента и критерия Манна ― Уитни. При p<0,05 различия считали значимыми. При этом соблюдались общие рекомендации для медицинских исследований.

Результаты

Для решения вопроса об участии ХНБ в прогрессировании экспериментальных спонтанно метастазирующих опухолей мы остановились на меланоме В16/F10. Средняя продолжительность жизни для мышей основной группы составила 19,17±1,35 дней, максимальная ― 24 дня. В группе сравнения ― первая смерть наступила на 24 сутки, средняя продолжительность их жизни составила 30,25±1,67 дня, максимальная ― 36 дней. У мышей из основной группы меланома В16 вела себя более агрессивно, поскольку метастазировала чаще, иногда в несколько органов и имела нетипичные для себя зоны метастазирования. Метастазы у мышей основной группы регистрировались уже через неделю после перевивки, а у мышей из группы сравнения ― через 4 недели. У мышей с ХНБ опухоль метастазировала кроме типичных мест ― в печень, селезенку и легкие, еще и в нетипичные ― сердце, матку.

Хроническая боль вызывала повышение уровня VEGF-А и VEGF-С в коже контрольных мышей-самок в 2,7 раза и 6,1 раза соответственно (табл. 1). Не равнозначным было влияние хронической боли на рецепторы факторов роста в этих образцах: уровень sVEGF-R1 повышался в 2,9 раза, а sVEGF-R3, напротив, снижался в 6,1 раза. Вместе с тем, уровень свободного VEGF-А, определяемого как соотношение VEGF-А/sVEGF-R1 не имело достоверных отличий между показателями в коже интактных животных и мышей с ХНБ (178,3±15,2 против 162,0±11,3). Содержание свободного VEGF-С в коже самок при этом увеличивалось под влиянием хронической боли ― VEGF-С/sVEGF-R3 был равен 37,6±2,4 против 1,0±0,2 в коже интактных мышей.

Таблица 1. Факторы ангиогенеза в коже и опухоли

Группы	VEGF-A пг/г ткани	sVEGF-R1 нг/г ткани	VEGF-С нг/г ткани	sVEGF-R3 нг/г ткани
Кожа интактная	169,4±8,3	0,95±0,1	6,8±0,5	6,7±0,6
Кожа ХНБ (контроль)	453,7±41,8¹	2,8±0,3¹	41,4±4,3¹	1,1±0,13¹
3 недели роста меланомы В₁₆/F₁₀ ― ткань опухоли
Группа сравнения	930,1±83,9¹	2,8±0,3¹	60,2±6,3¹	11,5±1,3¹
Основная группа	10634,9±797,6^1,2	6,8±0,9^1,2,3	90,6±8,8^1,2,3	1,1±0,1^1,3

Примечание: статистически значимые различия: 1 ― по сравнению с интактной кожей; 2 ― по сравнению с кожей ХНБ (контроль); 3 ― по сравнению с группой сравнения

Через 3 недели после перевивки опухоли в ткани опухоли мышей группы сравнения отмечено резкое нарастание по сравнению с интактными животными содержания факторов семейства VEGF: уровень VEGF-А возрос в 5,5 раза, sVEGF-R1 ― в 2,9 раза, уровень свободной фракции VEGF-А увеличился в 1,9 раза (VEGF-А/sVEGF-R1=332,2±35,1 против 178,3±11,3 в коже интактных мышей, р<0,05). Уровень VEGF-С увеличился в ткани опухоли самок группы сравнения в 8,9 раза, а содержание sVEGF-R3 ― в 1,7 раза по сравнению с интактными животными. В этой связи показатель уровня VEGF-С/sVEGF-R3 падал в коже мышей-самок группы сравнения в 5,2 раза (5,2±0,4 против 1,0±0,2 в коже интактных мышей, р<0,05).

Через 3 недели после перевивки опухоли на фоне ХНБ в ткани опухоли мышей основной группы уровень VEGF-А возрос в 23,4 раза, sVEGF-R1 ― в 2,4 раза относительно показателей в контрольной группе мышей с ХНБ. Уровень свободной фракции VEGF-А у мышей основной группы увеличился в 4,7 раза (VEGF-А/sVEGF-R1=1564,0±163,1 против 332,2±35,1 в коже мышей с ХНБ, р<0,05). Содержание VEGF-С увеличилось в ткани опухоли у самок контрольной группы в 2,2 раза, а содержание sVEGF-R3 не изменилось по сравнению с контрольными животными. В этой связи соотношение VEGF-С/sVEGF-R3 в коже самок мышей этой группы увеличилось в 2,2 раза (82,4±6,4 против 37,6±2,4, р<0,05).

В коже мышей контрольной группы с хронической болью был повышен уровень эстрадиола относительно ткани интактных животных в 3 раза, эстрона ― в 2,9 раза, прогестерона ― в 2,1 раза (табл. 2). Содержание общего тестостерона, свободного тестостерона и пролактина в коже мышей с хронической болью было снижено в 1,3 раза, 1,8 раза и 4,7 раза соответственно. Через 3 недели роста в ткани опухоли мышей группы сравнения повысился относительно показателя в коже интактных животных уровень эстрадиола в 1,3 раза и эстрона в 1,9 раза, при этом содержание общего тестостерона и пролактина оставалось без изменения, а уровень свободного тестостерона снижался в 2,1 раза. В этот же срок в ткани опухоли мышей основной группы увеличение содержания относительно показателей контрольной группы животных отмечено для эстрона ― в 1,3 раза, прогестерона ― в 1,6 раза и пролактина ― в 2,6 раза, при этом уровень эстрадиола, общего и свободного тестостерона оставался без изменений.

Таблица 2. Уровень половых гормонов и пролактина в коже и опухоли

Группы	Эстрадиол нМоль/ г ткани	Эстрон пМоль/г ткани	Тестосте-рон общ. нМоль/г ткани	Тестосте-рон своб. пМоль/г ткани	Прогестерон нМоль/г ткани	Пролактин мМЕ/г ткани
Кожа интактная	0,57±0,04	262,4±21,1	12,8±1,0	0,78±0,05	1,0±0,07	6,6±0,50
Кожа ХНБ (контроль)	1,7±0,14¹	769,0±62¹	9,8±0,8¹	0,43±0,04¹	2,1±0,2¹	1,4±0,12¹
3 недели роста меланомы В₁₆/F₁₀― ткань опухоли
Группа сравнения	0,74±0,04¹	494,5±30,8¹	12,8±1,2	0,37±0,03¹	1,1±0,1	5,5±0,2¹
Основная группа	2,0±0,2^1,3	1037±99,5^1,2,3	10,3±0,97	0,4±0,03¹	3,4±0,28^1,2,3	3,3±0,3^1,2,3

Наряду с содержанием гормонов, изменение рецепторного аппарата является одним из важных патогенетических механизмов роста злокачественных опухолей. Найдено, что у самок контрольной группы в коже в ответ на ХНБ резко возросло содержание эстрогеновых рецепторов ― ERα и ERβ в 3,7 раза и в 4 раза соответственно в сравнении с интактной кожей, и снизилась в 1,8 раз концентрация андрогеновых рецепторов (табл. 3). На уровень в коже рецепторов прогестерона ХНБ существенного влияния не оказала. Такие изменения, в совокупности с возрастанием содержания эстрадиола и эстрона и падением тестостерона, усугубляют создавшийся гормональный дисбаланс.

Таблица 3. Содержание рецепторов стероидных гормонов в коже и опухоли

Группы	ERɑ нг/г ткани	ERβ нг/г ткани	RP4 пг/г ткани	RA нг/г ткани	ERɑ/ERβ
Кожа интактная	2,2±0,2	2,02±0,19	0,21±0,02	0,22±0,02	1,09±0,01
Кожа ХНБ (контроль)	8,1±0,7¹	8,03±0,7¹	0,215±0,02	0,122±0,01¹	1,01±0,1
3 недели роста меланомы B₁₆/F₁₀― ткань опухоли
Группа сравнения	9,1±0,9¹	11,77±1,1¹	0,41±0,04¹	0,29±0,02¹	0,77±0,06¹
Основная группа	13,3±1,3^1,2,3	11,54±1,1^1,2	0,41±0,04^1,2	0,26±0,02²	1,15±0,1³

В ткани опухоли самок группы сравнения через 3 недели роста уровень рецепторов эстрогенов превышал показатели интактных животных: ERα в 4,1 раза, а ERβ в 5,9 раза, рецепторов прогестерона RP4 ― практически в 2 раза. Не найдено изменения уровня RA. В ткани опухоли у самок основной группы на этом сроке уровень всех рецепторов превышал показатели контрольной группы: ERα ― в 1,6 раза, а ERβ ― в 1,4 раза, RP4 ― в 1,9 раза, RA ― в 2,1 раза.

Результаты изучения концентрации биогенных аминов и их соотношения представлены в таблицах 4, 5. Обнаружено, что у самок контрольной группы в коже содержалось в 1,7 раза меньше гистамина и в 1,5 раза серотонина, чем у интактных животных. В то же время уровень норадреналина и дофамина оказался в 2,1 раза и в 1,4 раза больше, чем у интактных мышей (табл. 4). Коэффициенты дофамин/норадреналин (ДА/НА) и серотонин/5-ОИУК у животных с хронической болью были снижены в 1,5 раза и 1,8 раза соответственно, а норадреналин/адреналин (НА/А) ― повышен в 1,9 раза (табл. 5). Коэффициент адреналин/серотонин, демонстрирующий реципрокные отношения адренергической ― стрессреализующей и серотонинергической ― стресслимитирующей систем, оказался в 1,6 раза выше в коже у мышей с болью, по сравнению с интактными самками.

Таблица 4. Уровень биогенных аминов в коже и опухоли

Группы	Гистамин нг/г ткани	Адреналин нг/г ткани	Норадрена-лин нг/г ткани	Дофамин нг/г ткани	Серотонин нг/г ткани	5ОИУК Мг/г ткани
Кожа интактная	1357,7±105	3,2±0,3	5,8±0,48	30,9±2,8	0,41±0,04	0,32±0,03
Кожа ХНБ (контроль)	786,1±69¹	3,4±0,29	12,0±1,0¹	43,4±3,5¹	0,28±0,02¹	0,38±0,03
Опухоль 3 неделя роста меланомы В₁₆/F₁₀― ткань опухоли
Группа сравнения	109,3±9,8¹	4,2±0,4¹	12,6±1,2¹	64,3±6,1¹	0,52±0,05¹	0,23±0,02¹
Основная группа	21,0±1,9^1,2,3	5,2±0,5^1,2,3	8,8±0,8^1,2,3	19,4±1,5^1,2,3	0,39±0,03^2,3	0,48±0,04^1,2,3

Таблица 5. Соотношение биогенных аминов в коже и опухоли

Группы	ДА/НА	НА/А	Серотонин/5-ОИУК	А/серотонин
Кожа интактная	5,3±0,5	1,8±0,14	1,3±0,11	7,8±0,65
Кожа ХНБ (контроль)	3,6±0,32¹	3,5±0,31¹	0,74±0,07¹	12,1±1,1¹
Опухоль 3 неделя роста меланомы В₁₆/F₁₀– ткань опухоли
Группа сравнения	5,8±0,45	2,5±0,24¹	4,0±0,35¹	8,1±0,75
Основная группа	2,2±0,19^1,2,3	1,7±0,16^2,3	0,81±0,074^1,3	13,3±1,1^1,3

В ткани опухоли мышей группы сравнения через 3 недели после перевивки найдено резкое снижение уровня гистамина относительно показателя в коже интактных животных в 12,4 раза и 5-ОИУК в 1,4 раза на фоне повышения уровня адреналина в 1,3 раза, норадреналина ― в 2,2 раза, дофамина ― в 2,1 раза и серотонина ― в 1,3 раза. При этом были повышены только коэффициенты НА/А в 1,4 раза и серотонин/5-ОИУК в 3,1 раза.

Через 3 недели после перевивки в опухоли самок основной группы найдено снижение содержания норадреналина в 1,4 раза и дофамина в 2,2 раза, по сравнению с величинами в контроле. В то же время концентрация адреналина и серотонина в опухоли оказалась выше, чем в контроле в 1,5 раза и в 1,4 раза, соответственно. Повышение содержания серотонина сопровождалось снижением уровня 5-ОИУК в 1,3 раза. В результате этого в меланоме изменилось соотношение биогенных аминов: дефицит дофамина выявлялся не только по абсолютным величинам, но и по коэффициенту ДА/НА, который был снижен относительно показателя в контроле в 1,6 раза, в то же время превалировала адренергическая система, так как коэффициент НА/А в опухоли снижался в 2,1 раза.

Результаты исследования концентрации компонентов NO-системы в у самок мышей представлены в таблице 6. Было обнаружено, что у мышей контрольной группы концентрация ферментов NOS-2 и NOS-3 была увеличена, соответственно, в 1,5 раза и в 3,6 раза, концентрация нитротирозина ― в 1,3 раза по сравнению с группой интактных животных. Концентрация эндогенного ингибитора NO-синтазы АДМА была снижена в 1,8 раза, а концентрация субстрата ферментов ― аргинина ― в 1,7 раза.

Таблица 6. Концентрация компонентов NO-системы в коже и опухоли

Показатели	Животные без опухоли		Животные с меланомой В₁₆/F₁₀ через 3 недели ― ткань опухоли
Показатели	Кожа интактная	Кожа ХНБ (контроль)	Группа сравнения	Основная группа
NOS-2 (нг/г ткани)	1,1±0,10	1,6±0,14¹	3,1±0,29¹	3,8±0,35^1,2
NOS-3 (нг/г ткани)	0,75±0,07	2,7±0,02¹	3,7±0,35¹	5,06±0,49^1,2,3
АДМА (мкМ/г ткани)	0,27±0,02	0,15±0,01¹	0,37±0,04¹	0,34±0,031²
Аргинин (мкМ/г ткани)	44,6±4,2	25,7±2,5¹	14,1±1,35¹	21,5±2,1^1,3
Общий нитрит (мкМ /г ткани)	10,48±0,9	11,6±1,1	12,95±1,25	14,1±1,39¹
L-цитруллин (мкМ/г ткани)	8,2±0,78	7,6±0,74	15,9±1,48¹	13,7±1,31^1,2
Нитротирозин (нМ/г ткани)	0,81±0,07	1,05±0,09¹	1,16±0,10¹	1,06±0,09¹

Через 3 недели роста меланомы у мышей группы сравнения концентрация ферментов NOS-3 и NOS-2 в ткани опухоли была соответственно в 4,9 и в 2,8 раза выше, чем в коже интактных животных, также был повышен уровень АДМА в 1,4 раза, цитруллина ― в 1,9 раза и нитротирозина ― в 1,4 раза. Концентрация аргинина на данном сроке была ниже уровня в здоровой коже в 3,1 раза. Через 3 недели роста меланомы у мышей основной группы концентрация ферментов NOS-3 и NOS-2 в ткани опухоли была выше, чем в коже животных контрольной группы в 1,9 и в 2,4 раза соответственно, уровень АДМА был повышен в 2,3 раза, цитруллина ― в 1,8 раза.

Обсуждение

Активация сенсорной нервной системы в области злокачественной опухоли часто приводит к ощущению боли. Боль может предвещать развитие рака и может предоставить информацию о неопластической прогрессии, включая метастазы. Характер боли и продолжительность ее у онкологических больных полезно знать врачам и ученым, изучающим болезнь [5]. Стимуляция периферических афферентных ноцицепторов способствует боли при раке, однако молекулярные медиаторы и прямое взаимодействие, с помощью которых злокачественные или резидентные клетки модулируют ноцицепторы, точно не известны. Исследование основных элементов межклеточных путей позволило лучше понять этот процесс [6].

Ангиогенез порождает новые капилляры и, следовательно, приводит к васкуляризации тканей [7]. Ангиогенная активность у взрослых, как правило, низкая, за исключением заживления ран и женского репродуктивного тракта, где неоваскуляризация происходит как нормальный аспект менструального цикла [8]. VEGF является ключевым регулятором развития, физиологической и патологической неоваскуляризации, особенно вовлеченной в рост опухоли.

В настоящем исследовании показано, что ХНБ самок мышей активирует факторы ангиогенеза не только в коже, но и в ткани опухоли. При этом найдено значительное повышение уровня эстрогенов и прогестерона в указанных образцах. Считается, что неоваскуляризация в репродуктивных тканях регулируется стероидными гормонами, в частности 17-β-эстрадиолом [9]. Известно, что рецепторы эстрогена тесно связаны с ангиогенезом при различных видах рака [10]. Кроме того, при лечении эстроген-рецептор-положительного рака молочной железы селективные модуляторы эстрогенных рецепторов могут эффективно ингибировать ангиогенез [11].

VEGF является высокоспецифичным фактором стимуляции пролиферации сосудистых эндотелиальных клеток и образования коллатеральных сосудов [12]. Результаты исследования [13] продемонстрировали, что лечение 17-β-эстрадиолом стимулировало ангиогенез in vitro, указывая на то, что эстроген или его сигнальный путь могут представлять собой новый терапевтический метод в лечении артериальной недостаточности. Результаты исследования [14] показали, что параметры ангиогенеза могу быть изменены под влиянием экзогенных факторов, таких как гонадотропины и прогестерон.

Кроме увеличения уровня эстрогенов в настоящем исследовании показано, что ХНБ вызывала значимое увеличение уровня рецепторов эстрогенов в коже и ткани меланомы В16/F10. Эстрадиол связывается со своими классическими рецепторами ― ERɑ и ERβ и запускает геномные и негеномные эффекты. Экспрессия и функция рецепторов эстрогена являются тканеспецифичными. Классические механизмы взаимодействия эстрадиола с рецептором включают связывание лиганда, димеризацию рецептора и активацию эстрогенных элементов ответа в генах-мишенях, приводящих к активации или репрессии генов. Например, HIF-1α представляет собой транскрипционный фактор, предложенный в качестве кандидата для эстрадиол-индуцированной регуляции гена VEGFA [15].

Данные [16] показали, что эстроген может способствовать связыванию ER с сайтом ERE в промоторе β-катенин. Авторы заключают, что эстроген активирует β-катенин по-разному. На уровне генов эстроген побуждает ERα напрямую связываться с сайтом ERE промотора β-катенина. На уровне белка эстроген инактивирует GSK3β, чтобы уменьшить его деградацию. Накопленный β-катенин поступает в ядро для запуска передачи сигналов Wnt/β-катенин, что впоследствии приводит к усилению регуляции VEGF. Вкратце, передача сигналов Wnt/β-catenin действует как мост, соединяющий эстроген и VEGF.

У самок мышей под влиянием ХНБ в коже формировалось доминирование адренергической системы над серотонинергической, а также активация норадренергической системы. Можно провести некоторую параллель в реакции биогенного баланса кожи на ХНБ и развитие меланомы. Это касается повышения уровня норадреналина, дофамина и снижения серотонина. Очевидно, что изменения нейроэндокринного фона кожи являлись неспецифической реакцией организма, как на болевые воздействия, так и на введение злокачественных клеток, однако в первом случае, длительность воздействия привела к истощению защитных возможностей органа. Такое нарушение баланса между стрессреализующими и стресслимитирующими системами могло сказаться на локальной противоопухолевой защите и способствовать быстрому росту меланомы. Изменение нейроэндокринного фона под влиянием ХНБ, очевидно, оказало влияние на защитную функцию кожи, ослабив ее барьерные свойства.

Особый интерес представила редукция уровня гистамина в коже самок мышей. Гистамин влияет на многие иммунные процессы, модулирует функции кератиноцитов и меланоцитов, влияет на внутриклеточные сигнальные каскады, регулирующие пролиферацию клеток и меланогенез. Н4-рецепторы гистамина участвуют в активации лимфоцитов, эозинофилов и тучных клеток [17], доказана их роль в развитии аллергических заболеваний [18]. Низкий уровень гистамина под влиянием ХНБ может быть связан со снижением содержания тучных клеток в коже, что свидетельствует об угнетении местного иммунитета. Предполагают, что соблюдение равновесия в содержании гистамина и работе ферментов, метаболизирующих диамин, играет важную роль в неспецифической резистентности организма [19]. Некоторые экспериментальные исследования указывают на возможность применения синтетических агонистов Н4-рецептора гистамина или самого диамина, в качестве таргетных препаратов при меланоме кожи [20]. Эксперименты in vivo с первичной меланомой показали, что у мышей, получавших гистамин или клозапин, агонист для Н4-рецепторов гистамина, произошло увеличение медианы выживаемости, связанное с уменьшением опухолевого роста и внутриопухолевой неоваскуляризации [21].

Опухоли так же, как и органы, иннервируются волокнами симпатической нервной системы и способны к синтезу и/или захвату из окружающих тканей нейротрансмиттеров с целью аутокринно/паракринной регуляции своего роста [22]. Данные литературы о применении в эксперименте β-адреноблокаторов для снижения метастатического потенциала меланомы кожи подтверждают возможность такого воздействия хронической боли [23].

Результаты исследования различных моделей боли свидетельствуют об участии всех изоформ NO-синтаз и, следовательно, самого оксида азота в механизме развития воспалительной, нейрогенной, онкологической боли, герпетической аллодинии [24].

Анализируя результаты работы, очевидно, что функционирование вазоактивной NO-системы претерпевает значительные изменения, как в процессе обычного роста меланомы, так и в процессе роста опухоли на фоне ХНБ. Следует обратить внимание на то, что у самок мышей при развитии хронической боли наблюдается активация NO-системы в коже как за счет увеличения концентрации ферментов ― NOS-3 и NOS-2, так и за счет снижения уровня их эндогенного ингибитора АДМА. Обнаруженное на уровне статистической тенденции увеличение концентрации нитротирозина, может свидетельствовать о токсичности образующегося NO, например, в результате образования пероксинитрита. Это может способствовать ингибированию Т-клеточного ответа на опухолевые антигены [25, 26], вносимые в виде клеток перевиваемой меланомы В16/F10. Т.е., состояние хронической боли способствует развитию в коже состояния иммунологической толерантности, что может быть одной из причин показанного нами более раннего появления подкожных опухолей у мышей с ростом меланомы на фоне хронической боли [4].

Оксид азота является важным регулятором процессов, связанных с выживанием опухолевых клеток, их пролиферацией, инвазией [27]. Проопухолевые эффекты NO˙ дозозависимы и реализуются через регулирование экспрессии и активности NO-синтаз, активности процессов (де-)нитрозилирования. Установлена важная роль системы оксида азота (наряду с экспрессией проангиогенных факторов роста) в процессах ангиогенеза и лимфангиогенеза [28]. Ангиогенный эффект VEGF-А опосредуется действием оксида азота, т.к. активация сигнального пути VEGF-А активирует NOS-3, стимулируя образование NO в различных опухолях, в том числе и в меланоме [29]. Действие VEGF-C также связано со стимуляцией эндотелиальной NOS-3: ингибирование NOS-3 приводит к уменьшению количества опухолевых клеток, достигающих сторожевого лимфатического узла, и, таким образом, снижается вероятность образования макроскопических метастазов [30]. У пациентов с меланомой при повышенной экспрессии NOS-2 наблюдалось снижение выживаемости [29].

Результаты нашего исследования показывают, что при развитии у самок мышей меланомы В16 после стандартной перевивки в ткани опухоли наблюдается увеличение концентрации NOS-3 и NOS-2. При росте меланомы В16 на фоне ХНБ концентрация NOS-3 и NOS-2 в ткани опухоли также увеличивалась, при этом концентрация NOS-3 была выше, чем у мышей с обычным ростом меланомы. Как правило, более высокая экспрессия NOS и, соответственно, продуцирование NO˙ увеличивают вероятность S-нитрозилирования клеточных белков, которые могут способствовать онкогенезу [27]. Кроме того можно предположить, что увеличение концентрации ингибитора NO-синтаз АДМА может указывать на возможную активацию NOS-независимых путей метаболизма аргинина на определенных этапах роста меланомы В16/F10 с образованием, например, полиаминов, имеющих определенное значение в пролиферации опухолевых клеток и их выживании [31]. Некоторое накопление цитруллина в ткани опухоли при росте меланомы как после стандартной перевивки опухоли, так и на фоне ХНБ может быть следствием ингибирования его реакции с аспартатом (при превращении цитруллина в аргинин) ― поддержание пула аспартата для синтеза нуклеотидов в опухолевых клетках и обеспечения активности их пролиферации [32].

Заключение

Представленные в работе результаты могут являться подтверждением системного влияния хронической нейрогенной боли как фонового процесса, под воздействием которого значительно изменяется функционирование вазоактивной NO-системы и нейрогуморальной системы, приводя к формированию условий активации процессов ангиогенеза и стимуляции роста опухоли.

Литература

Яхно Н.Н., Кукушкин М.Л. Хроническая боль: медико-биологические и социально-экономические аспекты // Вестник РАМН. ― 2012. ― Т. 67, №9. ― С. 54-58. https://doi.org/10.15690/vramn.v67i9.407
Machelska H., Chelik M.Ö. Recent advances in understanding neuropathic pain: glia, sex differences, and epigenetics // F1000Research. ― 2016. ― №5. ― P. 2743.
Sheahan T.D., Siuda E.R., Bruchas M.R., et al. Inflammation and nerve damage minimally affect the voluntary behavior of the mouse, suggested as indicators of pain // Neurobiology of Pain. ― 2017. ― №2. ― P. 1-12.
Кит О.И., Франциянц Е.М., Котиева И.М., и др. Некоторые механизмы повышения злокачественности меланомы на фоне хронической боли у самок мышей // Российский журнал боли. ― 2017. ― №2 (53). ― С. 14-20.
Schmidt B.L. What Pain Tells Us About Cancer // Manage Pain. ― 2015. ― №156 (Suppl 1). ― P. 32-34.
Schmidt B.L. The Neurobiology of Cancer Pain // Neuroscientist. ― 2014. ― Vol. 20, №5. ― P. 546-562.
Ambrose C.T. The role of capillaries in the lesser ailments of old age and in Alzheimer’s disease and vascular dementia: The potential of pro-therapeutic angiogenesis // Journal of Alzheimer’s Disease. ― 2016. ― №54. ― Р. 31-43.
Elkilani O.A., Soliman M.A. Angiogenesis mediators in women with idiopathic heavy menstrual bleeding // International Journal of Gynecology & Obstetrics. ― 2017. ― №136. ― P. 280-284.
Dhole B., Gupta S., Venugopal S.K., Kumar A. Triiodothyronine stimulates VEGF expression and secretion via steroids and HIF-1α in murine Leydig cells // Syst. Biol. Reprod. Med. ― 2018. ― Vol. 64, №3. ― P. 191-201.
Bharti J.N., Rani P., Kamal V., Agarwal P.N. Angiogenesis in breast cancer and its correlation with estrogen, Progesterone receptors and other prognostic factors // Journal of Clinical and Diagnostic Research. ― 2015. ― Vol. 9, №1. ― P. 5-7.
Shim J.S., Li R., Lv J., et al. Inhibition of angiogenesis by selective estrogen receptor modulators through blockade of cholesterol trafficking rather than estrogen receptor antagonism // Cancer Letters. ― 2015. ― Vol. 362, №1. ― P. 106-115.
Cartland S.P., Genner S.W., Zahoor A., Kavurma M.M. Comparative evaluation of TRAIL, FGF-2 and VEGF-A-induced angiogenesis in vitro and in vivo // International Journal of Molecular Sciences. ― 2016. ― Vol. 17, №12. ― P. 2025.
Liu H., Tao Y., Chen M., et al. 17β-Estradiol Promotes Angiogenesis of Rat Cardiac Microvascular Endothelial Cells In Vitro // Medical Science Monitor. ― 2018. ― №24. ― P. 2489-2496.
Rashidi B., Mardani M., Karizbodagh M.P. Evaluation of Progesterone and Ovulation-stimulating Drugs on the Glandular Epithelium and Angiogenesis in Mice // Advanced biomedical research. ― 2017. ― №6. ― P. 116.
Fatima L.A., Campello R.S., Santos R.S., et al. Estrogen receptor 1 (ESR1) regulates VEGFA in adipose tissue // Scientific reports. ― 2017. ― Vol. 7, №1. ― P. 16716.
Ling Zhang, Wenqian Xiong, Yao Xiong, et al. 17 b-Estradiol promotes vascular endothelial growth factor expression via the Wnt/b-catenin pathway during the pathogenesis of endometriosis // Molecular Human Reproduction. ― 2016. ― Vol. 22, №7. ― P. 526-535. https://doi.org/10.1093/molehr/gaw025.
Takeshita K., Sakai K., Bacon K.B., Gantner F. Critical Role of Hista-mine H4 Receptor in Leukotriene B4 Production and Mast Cell-Dependent Neutrophil Recruitment Induced by Zymosan in Vivo // Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. — 2003. — Vol. 307, №3. ― P. 1072-1078.
Lazewska D., Kiec-Kononowicz K. Azines as histamine H4 receptor antagonists // Frontiers in Bioscience (Scholar Edition). ― 2012. ― Vol. 1, №4. ― P. 967-987.
Akhalaya M.Ya., Goncharenko E.N., Kudryashova N.Yu. Influence of natural radioprotector carnosine on histamine-diaminooxydase system in myocardium of rats after action of various extreme factors. // Радиационная биология. Радиоэкология. ― 2001. ― Т. 41, №1. ― С. 56-58.
Massari N.A., Medina V.A., Cricco G.P., et al. Antitumor activity of histamine and clozapine in a mouse experimental model of human melanoma // Journal of Dermatological Science. ― 2013. ― Vol. 72, №3. ― P. 252-262.
Massari N.A., Nicoud M.B., Sambuco L., et al. Histamine therapeutic efficacy in metastatic melanoma: Role of histamine H4 receptor agonists and opportunity for combination with radiation // Oncotarget. ― 2017. ― Vol. 8, №16. ― P. 26471-26491.
Li S., Sun Y., Gao D. Role of the nervous system in cancer metastasis (Review) // Oncology Letters. ― 2013. ― Vol. 5, №4. ― P. 1101-1111.
Wnorowski A., Sadowska M., Paul R.K., et al. Activation of β2-adrenergic receptor by (R,R’)-4′-methoxy-1-naphthylfenoterol inhibits proliferation and motility of melanoma cells // Cellular Signalling. ― 2015. ― Vol. 27, №5. ― P. 997-1007.
Yang Y., Zhang J., Liu Y., et al. Role of nitric oxide synthase in the development of bone cancer pain and effect of L-NMMA // Molecular Medicine Reports. ― 2016. ― Vol. 13, №2. ― P. 1220-1226.
Rodriguez P.C., Quiceno D.G., Ochoa A.C. L-arginine availability regulates T-lymphocyte cell-cycle progression // Blood. ― 2007. ― №109. ― P. 1568-1573.
Viola A., Bronte V. Metabolic mechanisms of cancer-induced inhibition of immune responses // Seminars in Cancer Biology. ― 2007. ― Vol. 17, №4. ― P. 309-316.
Rizi B.S., Abhinav Achreja, Deepak Nagrath. Nitric oxide ― the forgotten child of tumor metabolism // Trends in Cancer. ― 2017. ― Vol. 3, №9. ― P. 659-672.
Saleh A., Stathopoulou M.G., Dadé S., et al. Angiogenesis related genes NOS3, CD14, MMP3 and IL4R are associated to VEGF gene expression and circulating levels in healthy adults // BMC Medical Genetics. ― 2015. ― Vol. 5, №16. ― P. 90.
Vahora H., Khan M.A., Alalami U., Hussain A. The Potential Role of Nitric Oxide in Halting Cancer Progression Through Chemoprevention // European Journal of Cancer Prevention. ― 2016. ― Vol. 21, №1. ― P. 1-12.
Lahdenranta J., Hagendoorn J., Padera T.P., et al. Endothelial nitric oxide synthase mediates lymphangiogenesis and lymphatic metastasis // Cancer Research. ― 2009. ― №69. ― P. 2801-2808.
Peters M.C., Minton A., Phanstiel O., Gilmour S.K. A Novel Polyamine-Targeted Therapy for BRAF Mutant Melanoma Tumors // Medical Sciences (Basel). ― 2018. ― Vol. 6, №1. ― P. 3.
Rabinovich S., Adler L., Yizhak K., et al. Diversion of aspartate in ASS1-deficient tumours fosters de novo pyrimidine synthesis // Nature. ― 2015. ― №527. ― P. 379-383.