ВЛИЯНИЕ ЗЕАРАЛЕНОНА И ТРИХОТЕЦЕНА НА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ И ПРОЛИФЕРАТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ ЛИНИИ КЛЕТОК РАКА ШЕЙКИ МАТКИ (HELA)

от
Print Friendly, PDF & EmailРаспечатать / Сохранить в PDF

УДК 618.146:616-006.03

Л.Р. Валиуллин 1, И.И. Идиятов 1, Р.С.Мухаммадиев 1, В.И. Егоров 1, В.В. Бирюля 1, А.А.Набатов2, И.С. Рагинов 3-4

1ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», г. Казань

2ФГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет», г. Казань

3Приволжский филиал ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» РАМН, г. Казань

4ГАУЗ «Республиканская клиническая больница» МЗ РТ, г. Казань

Валиуллин Ленар Рашитович — кандидат биологических наук, заведующий сектором тканевых технологий и производства препаратов Федерального центра токсикологической, радиационной и биологической безопасности

420074, г. Казань, Научный городок, 2, тел. +7-950-969-84-69, e-mail: Valiullin27@mail.ru

Реферат. В настоящее время онкологические заболевания стали одной из самых серьезных проблем для общественного здравоохранения во всем мире. Онкозаболевания являются основной причиной смерти в развитых странах и второй по значимости в развивающихся странах. В данной работе были изучены цитостатические свойства зеараленона и трихотецена при воздействии на линию клеток рака шейки матки (Hela). Было установлено, что зеараленон понижает жизнеспособность клеток рака шейки матки в концентрации 4,1х10-4М на 24,5%, а трихотецен в значительно меньшей концентрации, 4,1х10-8М, снизил жизнеспособность данных клеток на 42,0% в сравнении с контролем. На основании полученных результатов открывается возможность продолжения исследований в области разработок препаратов направленного действия против рака шейки матки, которые должны обладать не только высоким цитотоксическим действием, но и повышенными проникающими и биорезорбируемыми параметрами, что означает меньшее отрицательное воздействие на организм человека.

Ключевые слова: раковые клетки линии Hela, зеараленон, трихотецен, цитотоксичность, жизнеспособность, пролиферативная активность.

Введение

Онкологические патологии на данный момент являются одними из самых распространенных заболеваний человека. Рак шейки матки (РШМ) входит в десятку самых распространенных онкологических заболеваний и занимает 5-е место. Ежегодно в мире регистрируют 528 тыс. больных РШМ и 266 тыс. умерших от этого заболевания. РШМ занимает 2-е ранговое место в структуре онкогинекологической патологии и 5-е ранговое место в структуре всех опухолей у женщин [1]. Заболеваемость и смертность от данного типа новообразований значительно снизились за последние годы благодаря внедрению современных и точных методов диагностики и массового скрининга женщин [2]. Однако специалисты отмечают негативную тенденцию в отношении возникновения рецидивов, которые при I стадии составляют 8,3%; II — 21,3%; III — 29,1% и при IV стадии — 43,5% [3]. Одним из основных факторов, влияющих на рецидивирование РШМ, является отсутствие эффективных химиотерапевтических препаратов.

Широкими цитотоксическими свойствами обладают метаболиты микроскопических грибов, которые применяются в ветеринарии и медицине. Фармакологический эффект включает в себя противомалярийную, противомикробную, противовирусную и противоопухолевую активность [4, 5]. Зеараленон и производные трихотеценов, такие как ниваленол, самбуцинол, трихотеллон, триходермол, трихотецин В и трихотецинол А обладают цититоксической активностью в отношении широкого спектра различных типов клеточных линий [5-8]. Преимущество зеараленона и трихотецена заключается в их способности проникать через гематоэнцефалический барьер в связи с низкой молекулярной массой и высокой биоразлагающей способностью в организме теплокровных [9-12].

В связи с отсутствием высокоэффективных препаратов для лечения РШМ целью наших исследований было изучение цитостатических свойств зеараленона и трихотецена на клеточную линию рака шейки матки (Hela) в различных концентрациях.

Материал и методы

В работе использовали зеараленон и трихотеценовое соединение 4β,15-диацетокси-8α-(3α-метилбутирилокси)-12,13-эпокситрихотецен-3-ол низшего гриба Fusarium sp., полученые в лаборатории Федерального центра токсикологической, радиационной и биологической безопасности (ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ») [9]. Клеточные линии рака шейки матки (Hela) человека были предоставлены Научно-образовательным центром фармацевтики Казанского (Приволжского) федерального университета. Клетки культивировались в среде DMEM в присутствии 10% фетальной телячьей сыворотки при 37°С и 5% СО2. Препараты растворялись в смеси ДМСО и 96% спирта в соотношении (1:1).

Для эксперимента было сформировано 11 групп. Клеточная культура первой группы служила контролем, в нее вводили дистиллированную воду в том же объеме, что и в исследуемых группах. В клеточные культуры второй, третьей, четвертой, пятой, шестой, седьмой, восьмой, девятой, десятой и одиннадцатой групп вводили суспензию зеараленона в дозах 1,2х10-4; 1,6х10-4; 1,9х10-4; 2,1х10-4; 2,4х10-4; 2,7х10-4; 3,1х10-4; 3,4х10-4; 3,7х10-4 и 4,1х10-4М соответственно. В культуры клеток трихотецен в дозе 1,2х10-8; 1,6х10-8; 1,9х10-8; 2,1х10-8; 2,4х10-8; 2,7х10-8; 3,1х10-8; 3,4х10-8; 3,7х10-8 и 4,1х10-8М соответственно.

Влияние исследуемых веществ на клетки изучали методом культивирования клеток в присутствии данных соединений. После 24 часов культивирования клеточный слой с помощью инвертированного микроскопа оценивали по следующим параметрам: процент покрытия поверхности, форма клеток, количество клеточных агрегатов, количество плавающих клеток. Подсчет клеток осуществляли в камере Горяева. Количество живых и мертвых клеток оценивали методом окраски трипановым синим (0,1%-ный раствор) [4]. Влияние исследуемых соединений на культурально-морфологические свойства клеток определяли с учетом следующих параметров: коэффициента жизнеспособности — отношения живых клеток к общему их количеству, выраженное в процентах; активность пролиферации — отношения числа выросших клеток к числу засеянных [5]; процента гибели клеток — отношения мертвых клеток, оставшихся после экспозиции с соединением, к общему числу клеток после экспозиции с соединением [13].

Статистическую обработку результатов осуществляли методом вариационной статистики с использованием программы Microsoft Office Excel 2013. Достоверность разницы между сравнимыми величинами оценивали по критерию Стьюдента.

Собственные исследования

Влияние соединений зеараленона и трихотецена на жизнеспособность раковых клеток представлено на рис. 1.

Рис. 1 Влияние соединений зеараленона и трихотецена на жизнеспособность раковой клетки линии Hela

При воздействии вторичного метаболита производного трихотецена на раковую клетку линии Hela жизнеспособность во второй, третьей и четвертой группах уменьшилась незначительно. В пятой, шестой, седьмой, восьмой, девятой, десятой и одиннадцатой группах жизнеспособность клеток уменьшилась на 9,4; 13,3; 16,2; 19,5; 28,1; 31,2 и 42,0% в сравнении с контролем.

Исследование пролиферативной активности при воздействии на клеточную линию Hela соединений зеараленон и трихотецена представлены на рис. 2.

Рис. 2. Исследование пролиферативной активности при воздействии на клеточную линию соединений зеараленона и трихотецена

Из рис. 2 видно, что при воздействии зеараленона на раковую клетку пролиферативная активность во второй, третьей и четвертой группах уменьшилась незначительно. В пятой, шестой, седьмой, восьмой, девятой десятой и одиннадцатой группах пролиферативная активность клеток уменьшилась на 9,1; 13,8; 18,9; 25,0; 30,1; 38,9 и 48,5% в сравнении с контролем. При воздействии метаболита трихотецена на клеточную культуру пролиферативная активность во второй и третьей группах уменьшилась незначительно. В четвертой, пятой, шестой, седьмой, восьмой, девятой, десятой и одиннадцатой группах пролиферативная активность клеток уменьшилась на 10,0; 17,8; 23,7; 32,3; 43,2; 50,1; 61,0 и 71,8% в сравнении с контролем.

Изучение цитотоксических свойств потенциальных противораковых соединений зеараленона и трихотецена при воздействии на культуру клеток линии Hela представлены на рис. 3.

Из рис. 3 видно, что во второй, третьей, четвертой, пятой и шестой группах при воздействии зеараленона не наблюдалось значительных изменений в цитотоксичности. В седьмой группе в концентрации микроорганизмов в 2,7х10-4М наблюдалось понижение цитотоксического индекса на 12,0%, в восьмой группе — понижение индекса цитотоксичности клеток на 16,7% относительно контроля. В девятой и десятой группах при концентрации микроорганизмов с 3,4х10-4, 3,7х10-4М снижение данного показателя относительно контроля составило 23,0 и 29,2% соответственно. В одиннадцатой группе снижение цитотоксического индекса клеточной линии составило 40,0% по сравнению с контролем.

Из рис. 3 видно, что во второй, третьей, четвертой и пятой группах при воздействии трихотецена не наблюдалось значительных изменений в цитотоксичности. В шестой группе в концентрации микроорганизмов в 2,7х10-4М наблюдалось понижение цитотоксического индекса на 21,0% соответственно. В седьмой и восьмой группах наблюдалось понижение индекса цитотоксичности клеток на 30,0 и 40,2 относительно контроля. В девятой и десятой группах при воздействии трихотецена в дозах 3,4х10-8 и 3,7х10-8М снижение данного показателя относительно контроля составило 48,4 и 54,1% соответственно. В одиннадцатой группе снижение цитотоксического индекса клеточной линии составило 63,9% по сравнению с контролем.

Заключение

Исследование цитотоксических свойств вторичных метаболитов микроскопических грибов на линию клеток рака шейки матки (Hela) показало, что метаболиты зераленон и трихотецен в различных дозах вызывали понижение жизнеспособности и пролиферативной активности данных раковых клеток. Трихотецен проявлял значительно более высокие цитотоксические свойства по сравнению с зеараленоном. В связи с представленными данными изучение метаболитов микроскопических грибов зеараленона и трихотеценов открывает возможности их дальнейшего изучения с целью разработки новых перспективных препаратов для лечения онкологических заболеваний различной этиологии.

Литература

  1. Давыдов М.И., Аксель Е.М. Статистика злокачественных новообразований в России и странах СНГ в 2012 году. — М.: Медицинское информационное агентство, 2012. — С. 143.
  2. Состояние онкологической помощи населению России в 2016 году / Под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. — М.: МНИОИ им. П.А. Герцена, 2017. — С. 236.
  3. Гуськова Е.А., Неродо Г.А., Гуськова Н.К. и др. Факторы, влияющие на частоту рецидивирования рака шейки матки // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. — 2015. — №10(1). — С. 87-91.
  4. Валиуллин Л.Р., Бирюля В.В., Идиятов И.И., Касанова Н.Р., Набатов А.А. Изучение изменений биохимических показателей культур клеток при воздействии Т-2 токсина // Уч. Зап. КГАВМ им. Н.Э. Баумана. — 2018. — Т. 236, №4. — С. 39-43.
  5. Тертичная М.В. «Методика» по определению цитотоксичности медицинских металлических изделий, утвержденная директором ФГНУ ВНИВИ и генеральным директором ГУП ВНИПИМИ (2002).
  6. Hussaini A. Mycotoxin and Food Safety in Developing Countries; 2013. 280 p. http://dx.doi.org/10.5772/3414.
  7. Leylaie S., Zafari D. Antiproliferative and antimicrobial activities of Secondary metabolites and phylogenetic study of endophytic Trichoderma species from Vinca plants. Frontiers in Microbiology. 2018; 9:1484-1500. doi:10.3389/fmicb.2018.01484.
  8. Islam M.T., Mishra S.K., Tripathi S. et. al. Mycotoxin-assisted mitochondrial dysfunction and cytotoxicity: Unexploited tools against proliferative disorders. J IUBMB Life. 2018. doi: 10.1002/iub.1932.
  9. Wang Y., Zhang L., Li G.-T., Li Z.-H., Dong Z.-J., Li Y. Identification and cytotoxic activities of two new trichothecenes and a new cuparane-type sesquiterpenoid from the cultures of the mushroom Engleromyces goetzii // J Nat Prod Bioprospec. — 2015;5:47-53. doi:10.1007/s13659-014-0051-1.
  10. Jia W., Shi L., Zhang F. et. al. Multiplexing data independent untargeted workflows for mycotoxins screening on a quadrupole-Orbitrap high resolution mass spectrometry platform // Food Chem. — 2019. doi: 10.1016.
  11. Yang S., Zhang H., Sun F. et. al. Metabolic Profile of Zearalenone in Liver Microsomes from Different Species and Its in Vivo Metabolism in Rats and Chickens Using Ultra High-Pressure Liquid Chromatography-Quadrupole / Time-of-Flight Mass Spectrometry // J Agric Food Chem. — 2017. doi: 10.1021.
  12. Yang S., Zhang H., Beier R.C. et. al. Comparative metabolism of Lappaconitine in rat and human liver microsomes and in vivo of rat using ultra high-performance liquid chromatography-quadrupole/time-of-flight mass spectrometry // J Pharm Biomed Anal. 2015 Jun 10;110:1-11. doi: 10.1016.
  13. Nabatov A.A., Raginov I.S. The DC-SIGN-CD56 interaction inhibits the anti-dendritic cell cytotoxicity of CD56 expressing cells // J Infectious Agents and Cancer. 2015. doi: 10.1186.