НОВАЯ МОДЕЛЬ ИЗУЧЕНИЯ ОПУХОЛЕЙ IN VIVO

от
Print Friendly, PDF & EmailРаспечатать / Сохранить в PDF

© И.С. Рагинов, В.И. Егоров, Л.Р. Валиуллин, И.Р. Сафин, Ю.Г. Штырлин, А.Г. Иксанова, Р.Ш. Хасанов, 2019

УДК 616-006-07

И.С. Рагинов2-5, В.И. Егоров4, Л.Р. Валиуллин4, И.Р. Сафин1, Ю.Г. Штырлин3, А.Г. Иксанова3, Р.Ш. Хасанов2

1ГАУЗ «Республиканский клинический онкологический диспансер МЗ РТ», г. Казань

2Приволжский филиал ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» РАМН, г. Казань

3ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет», г. Казань

4ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», г. Казань

5ГАУЗ «Республиканская клиническая больница» МЗ РТ, г. Казань

Рагинов Иван Сергеевич ― доктор медицинских наук, заведующий патологоанатомическим отделением ГАУЗ «Республиканский клинический онкологический диспансер МЗ РТ», профессор кафедры биомедицинской инженерии и управления инновациями Инженерного института ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет», старший научный сотрудник Научно-образовательного центра фармацевтики

420064, г. Казань, Оренбургский тракт, д. 138, тел. +7-903-340-18-81, e-mail: raginovi@mail.ru

Реферат. При проведении фундаментальных и прикладных исследований в онкологии низкая корреляция результатов, получаемых в эксперименте и клинике, диктует необходимость разработки новых моделей опухолей. В этом плане наиболее перспективны модели in vivo. Мы исследовали рост опухолей человека после ксенотрансплантации в переднюю камеру глаза кролика и влияние на этот процесс цитостатиков. Было проведено 3 серии экспериментов по ксенотрансплантации миксофибросаркомы, саркомы кости и аденокарциномы желудка. В первых двух сериях исследована реакция ксенотрансплантированных опухолей на вводимый доксорубицин. Животным третьей серии ксенотрансплантировали аденокарциному желудка и исследовали влияние цисплатина. Фотографирование и последующая оценка размеров трансплантированных опухолей показала динамику их реакции на цитостатики и ангиогенеза. Ежедневное наблюдение за опухолями в условиях, наиболее соответствующих организму больного, позволяет точно охарактеризовать постоянно меняющиеся межклеточные взаимодействия с одной стороны и влияние цитотоксических препаратов с другой стороны.

Ключевые слова: опухоль, ксенотрансплантация, цитостатики.

Введение

Более 60 лет назад было показано, что передняя камера глаза является иммунологически привилегированной областью [1] и в ней не происходят реакции отторжения трансплантированных тканей, в том числе и опухолей [2-9]. Отсутствие иммунных реакций в отношении клеточных трансплантатов обеспечивается: 1) отсутствием кровеносных и лимфатических сосудов [10], 2) экспрессией Fas лиганда клетками эпителия роговицы и эндотелия [11], 3) высоким содержанием цитокинов (например, TGFb), которые подавляют иммунные реакции [12], при этом ключевое значение для поддержания иммуносупрессивных свойств имеют симпатические нервы [13]. Опухоль оказывает системное воздействие на организм за счет презентации антигенов внутри передней камеры глазного яблока [3, 5]. Все вышеперечисленные исследования посвящены трансплантации клеточных линий опухолей, а не их фрагментов.

При увеличении размеров опухоли более 2 мм опухолевые клетки находятся в условиях гипоксии [14]. При недостатке кислорода в опухолевых клетках происходит селекция генотипа, поддерживающего выживание клеток в условиях гипоксии: мутирует опухоль-подавляющий ген р53 [15]; изменяется экспрессия генов, подавляющих апоптоз [16] и поддерживающих аутофагию [17]; преобладают анаболические процессы [18]; снижается восстановление ДНК [19]; усиливаются опосредованные тирозин-киназным каскадом реакции [20]; становится возможной эпителиально-мезенхимальная трансдифференцировка [21], что усиливает инвазивность [22]; метастазирование [23] и подавление иммунных реакций [24]. При гипоксии в клетках повышается уровень р53, индуцирующий остановку клеточного цикла и апоптоз, что может объяснять задержку развития рецидива, наличие «дремлющих» микрометастазов и остановку роста больших по объему опухолей [25]. Однако, повышение образования свободных радикалов и, как следствие, увеличение количества мутаций ведет к нарушению этого механизма [26]. При гипоксии тканей в клетках активируется индуцированный гипоксией фактор (HIF), который стимулирует экспрессию сотни генов [27]. Одним из ключевых эффектов является переход от окислительного метаболизма к гликолитическому [28], а так же стимулирует метастазирование [29] и устойчивость к радиации [30]. В условиях гипоксии опухолевые клетки для образования АТФ переключаются с использования глюкозы на глютамин. При культивировании клеток саркомы или лимфомы отсутствие глютамина полностью прекращало их пролиферацию [31, 32]. Для рака мочевого пузыря, матки, мозга, ободочной кишки, легкого, яичника, простаты и желудка показана корреляция между увеличением экспрессии HIF и уменьшением продолжительности жизни [33]. В условиях гипоксии основные клетки стромы (фибробласты и макрофаги) начинают секретировать факторы, стимулирующие опухолевый процесс [34]. За счет активации внутриклеточных механизмов опухоли приобретают устойчивость к повреждающему действию ионизирующего излучения и противоопухолевых препаратов [16]. Так, за счет остановки клеточного цикла в стадии G1 или G2 снижается эффективность фторурацила; увеличение расстояния от сосудов увеличивает резистентность к таксанам, а закисление внеклеточного матрикса снижает чувствительность к доксорубицину [35].

Учитывая, что гипоксия является главным условием, поддерживающим устойчивость опухолевых клеток к лечению, целью нашей работы явилась разработка методики ксенотрансплантации фрагментов опухолей в переднюю камеру глаза кроликов.

Материал и методы

В эксперименте использовали 54 кролика обоих полов весом 2800-3500 г. Животных содержали в стандартных условиях со свободным доступом к воде и корму. Было проведено 3 серии экспериментов по ксенотрансплантации фибросаркомы, саркомы кости и аденокарциномы желудка. В первых двух сериях исследована реакция ксенотрансплантированной саркомы на вводимый доксорубицин. Животные в обеих сериях были поделены на 2 группы по 9 кроликов в каждой группе (табл. 1). Животным третьей серии ксенотрансплантировали аденокарциному желудка и исследовали влияние Цисплатина (Тева).

Таблица 1. Количество животных в экспериментальных группах

Серия и вид опухоли

Контроль

Опыт

1. Миксофибросаркома

9

9 Доксорубицин

2. Саркома

9

9 Доксорубицин

3. Аденокарцинома желудка

9

9 Цисплатин
 

1. Хирургические манипуляции

Всем животным осуществляли ксенотрансплантацию опухоли.

  1. Забор операционного материала в питательную среду DMEM и транспортировка к месту операции (не более 1,5 часов).
  2. Перед трансплантацией из опухоли получали фрагменты кубической формы со стороной 3 мм. Такой размер фрагмента обеспечивает гипоксию в центральной части.
  3. Кроликам под ингаляционным наркозом хлороформом, рассекали роговицу по середине между центральной частью и склерой.
  4. Пользуясь пинцетом, имплантировали опухоль под роговицу в переднюю камеру глаза (рис. 1).

Рис. 1. Передняя камера глаза с трансплантированной опухолью (красного цвета). Стрелками показано направление циркуляции внутриглазной жидкости

2. Введение цитостатиков

Начиная со следующего дня после операции всем животным начинали делать иньекции. Кроликам контрольных групп вводили физиологический раствор в объеме 1 мл/кг. Кроликам опытных групп  вводили лекарственный препарат (растворы исходных компонентов готовили на воде для инъекций):

а) раствор доксорубицина (Фармстандарт, Россия) через сутки вводили внутрибрюшинно в возрастающей концентрации для исключения осложнений заживления травмированной роговицы; первые две инъекции ― 1 мг/кг, следующие две ― 2 мг/кг и далее ― 3 мг/кг.

б) цисплатин животные получали в дозе 1 мг/кг через день.

3. Анализ размеров трансплантированной опухоли

У всех животных через сутки фотографировали трансплантированные фрагменты опухоли для оценки изменения их размеров. На изображениях осуществляли подсчёт площади опухоли при помощи градуированной сетки (рис. 2).

Рис. 2. Опухоль в передней камере глаза кролика. При помощи линейки (синяя точка) определяется цена деления сетки, программно накладываемой на фотографию

Через 30 суток после операции у животных были выделены трансплантаты и фиксированы в 10% формалине. Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и проводили иммуногистохимическое выявление виментин-позитивных (опухолевых) клеток.

Иммуногистохимическое исследование

Для выявления экспрессии виментина (разведение 1:100, DAKO, Denmark) использовали непрямой иммунопероксидазный метод и моноклональные кроличьи (мышиные) антитела, применяя LSAB-kit (DAKO, Denmark). Виментин — маркер клеток мезенхимного происхождения, экспрессируется клетками опухолей соединительной ткани (саркомы). Учитывая, что мы использовали антитела, связывающиеся только с антигенами человека, виментин служил для выявления ксенотрансплантированных опухолевых клеток. Иммуногистохимический анализ проводился на срезах толщиной 4 мкм. Визуализацию иммуногистохимических реакций осуществляли раствором, содержащим аминоэтилкорбазол и перекись водорода в ацетатном буфере (рН 6,4). Заключали срезы в глицерин-желатин.

Результаты

Эксперимент с миксофибросаркомой

Только у одного животного опытной группы (введение доксорубицина) из одного глаза произошло самостоятельное отхождение трансплантата. У всех остальных животных опухоль сохранялась на всём протяжении эксперимента. Признаки воспаления не определялись (рис. 3). Сосуды в опухоль не прорастали. После трансплантации размеры опухолей во всех группах начали возрастать. В контрольной группе (без введения препарата) размер опухоли к 30 суткам увеличился на 39±4,2% (Р<0,05). К 12 суткам после трансплантации в опытной группе (введение доксорубицина) увеличение размера опухоли составило 48±4,7% (Р<0,05). После этого срока размеры опухоли достоверно не изменялись (рис. 4).

Морфологическое исследование во всех группах показало врастание опухоли в область травмы роговицы, а также отсутствие кровеносных сосудов и очагов некроза.

Рис. 3. Миксофибросаркома в передней камере глаза кролика на 2 сутки после ксенотрансплантации

Рис. 4. Изменение размеров ксенотрансплантированной миксофибросаркомы под влиянием доксорубицина. Контроль — без введения химиопрепаратов, опыт — введение доксорубицина. По оси ординат — площадь опухоли в мм2, по оси абсцисс — время после трансплантации в сутках

Эксперимент с остеосаркомой

После ксенотрансплантации кровеносные сосуды в опухоли не визуализировались. В контрольной группе у одного животного произошло отхождение ксенотрансплантата. К 15 суткам во всех группах не наблюдалось статистически значимого увеличения размеров опухоли (рис. 5, 6).

Рис. 5. Остеосаркома в передней камере глаза кролика на 2 сутки после ксенотрансплантации

Рис. 6. Глаз кролика на 15 сутки после ксенотрансплантации остеосаркомы на фоне действия доксорубицина

Иммуногистохимическое исследование

К 30 суткам после операции в трасплантированной миксофибросаркоме определяется достоверно меньшее количество клеток чем в контроле (рис. 7-9).

Рис. 7. Микрофотография миксофибросаркомы на 30 сутки инкубации в передней камере глаза. Контрольная группа. Осадок красного цвета соответствует позитивной иммуногистохимической реакции с антителами против виментина. Х600

Рис. 8. Микрофотография миксофибросаркомы на 30 сутки инкубации в передней камере глаза на фоне введения доксорубицина. Стрелкой показана виментин-позитивная (опухолевая) клетка. Х600

Рис. 9. Количество виментин-позитивных (опухолевых) клеток в ксенотрансплантате на 30 сутки после операции

Эксперимент с ксенотрансплантацией аденокарциномы и химиотерапией цисплатином

В контрольной группе у большинства животных на 3 сутки после ксенотрансплантации в опухоли стали заметны кровяные островки (рис. 10), которые к 5 суткам значительно расширились, сформировались в сосуды (рис. 11). В среднем на 13 сутки опухоль приобретает желтое окрашивание (рис. 12), что является признаком её гибели. К 30 суткам размеры ксенотрансплантата незначительно уменьшились по сравнению с 3 сутками, в части опухоли видна сеть сосудов (рис. 13). К этому сроку на гистологическом срезе определяется соединительная ткань со множеством кровеносных сосудов.

Рис. 10. Аденокарцинома на 3 сутки после ксенотрансплантации в переднюю камеру глаза. Красная стрелка указывает на кровяной островок

Рис. 11. Аденокарцинома на 5 сутки после ксенотрансплантации в переднюю камеру глаза

Рис. 12. Аденокарцинома на 13 сутки после ксенотрансплантации в переднюю камеру глаза

Рис. 13. Аденокарцинома на 30 сутки после ксенотрансплантации в переднюю камеру глаза

Под влиянием цисплатина динамика роста сосудов значительно отличается от контроля. Кровяные островки появляются только на 9 сутки после ксенотрансплантации и не визуализируются к 16 суткам у большинства животных (рис. 14). Размер ксенотрансплантата, уменьшившись к 9 суткам на 38% (P<0,05), в дальнейшем не изменялся (рис. 15). К этому сроку на гистологическом срезе определяется соединительная ткань со множеством кровеносных сосудов.

 

Рис. 14. Аденокарцинома после ксенотрансплантации в переднюю камеру глаза на фоне введения цисплатина: А — на 3 сутки после операции, Б — 9 сутки, В — 16 сутки

Рис. 15. Аденокарцинома на 30 сутки после ксенотрансплантации в переднюю камеру глаза на фоне введения цисплатина

Полученные данные свидетельствуют о продолжении роста миксофибросаркомы после трансплантации в переднюю камеру глаза и о способности доксорубицина оказывать не неё цитотоксическое действие.

Результаты нашего исследования показали принципиальное отличие в неоваскуляризации сарком и аденокарцином. В саркомы кровеносные сосуды не прорастают, в отличие от аденокарцином. Вероятно, это связано с большим количеством опухолевых клеток, секретирующих в условиях гипоксии ангиогенные факторы (VEGF и др.), в аденокарциномах по сравнению с саркомами.

Заключение

Предлагаемая методика мониторинга опухолевых клеток в организме животного позволит изменить представления о раке. Ежедневное наблюдение за опухолевыми клетками в условиях, наиболее соответствующих организму больного, позволяет точно охарактеризовать постоянно меняющиеся межклеточные взаимодействия с одной стороны и влияние цитотоксических препаратов с другой стороны.

Литература

  1. Medawar P. Immunity to homologous grafted skin. III. The fate of skin homografts transplanted to the brain, to subcutaneous tissue and to the anterior chamber of the eye // Br. J. Exp. Pathol. ― 1948. ― Vol. 29, №1. ― P. 58-69.
  2. Streilein J.W. Immune regulation and the eye: a dangerous compromise // FASEB J. ― 1987. ― Vol. 1, №3. ― P. 199-208.
  3. Streilein J.W., Niederkorn J.Y., Shadduck J.A. Systemic immune unresponsiveness induced in adult mice by anterior chamber presentation of minor histocompatibility antigens // J. Exp. Med. ― 1980. ― Vol. 152, №4. ― P. 1121-1125.
  4. Streilein J.W., Niederkorn J.Y. Characterization of the suppressor cell(s) responsible for anterior chamber-associated immune deviation (ACAID) induced in BALB/c mice by P815 cells // J. Immunol. ― 1985. ― Vol. 134, №3. ― P. 1381-1387.
  5. Mizuno K., Clark A.F., Streilein J.W. Anterior chamber-associated immune deviation induced by soluble antigens // Invest. Ophthalmol. Vis Sci. ― 1989. ― Vol. 30, №6. ― P. 1112-1119.
  6. Wilbanks G.A., Streilein J.W. Characterization of suppressor cells in anterior chamber-associated immune deviation (ACAID) induced by soluble antigen: evidence of two functionally and phenotypically distinct T-suppressor cell populations // Immunology. ― 1990. ― Vol. 71, №3. ― P. 383-389.
  7. Niederkorn J., Streilein J.W., Shadduck J.A. Deviant immune responses to allogeneic tumors injected intracamerally and subcutaneously in mice // Invest. Ophthalmol. Vis Sci. ― 1981. ― Vol. 20, №3. ― P. 355-363.
  8. Niederkorn J.Y., Streilein J.W. Lymphoma allografts abrogate immune privilege within the anterior chamber of the eye // Invest. Ophthalmol. Vis Sci. ― 1986. ― Vol. 27, №8. ― P. 1235-1243.
  9. Streilein J.W., Masli S., Takeuchi M., Kezuka T. The eye’s view of antigen presentation // Human Immunol. ― 2002. ― Vol. 63, №6. ― P. 435-443.
  10. Barker C.F., Billingham R.E. Immunologically privileged sites // Adv. Immunol. ― 1977. ― Vol. 25. ― P. 1-54.
  11. Griffith T.S., Brunner T., Fletcher S.M., Green D.R., Ferguson T.A. Fas ligand-induced apoptosis as a mechanism of immune privilege // Science. ― 1995. ― Vol. 270, №5239. ― P. 1189-1192.
  12. Niederkorn J.Y., Larkin D.F. Immune privilege of corneal allografts // Ocul Inflamm. ― 2010. ― Vol. 18, №3. ― P. 162-171.
  13. Vega J.L., Keino H., Masli S. Surgical denervation of ocular sympathetic afferents decreases local transforming growth factor-b and abolishes immune privilege // Am. J. Pathol. ― 2009. ― Vol. 175, №3. ― P. 1218-1225.
  14. Svensson R., Shaw R. Tumour friend or foe // Nature. ― 2012. ― Vol. 485. ― P. 590-591.
  15. Graeber T. et al. Hypoxia-mediated selection of cells with diminished apoptotic potential in solid tumours // Nature. ― 1996. ― Vol. 379. ― P. 88-91.
  16. Erler J.T. et al. Hypoxia-mediated down-regulation of Bid and Bax in tumors occurs via hypoxia-inducible factor 1-dependent and -independent mechanisms and contributes to drug resistance // Mol. Cell. Biol. ― 2004. ― Vol. 24. ― P. 2875-2889.
  17. Rouschop K. et al. The unfolded protein response protects human tumor cells during hypoxia thro ugh regulation of the autophagy genes MAP1LC3B and ATG5 // J. Clin. Invest. ― 2010. ― Vol. 120. ― P. 127-141.
  18. Cairns R., Harris I., Mak T. Regulation of cancer cell metabolism // Nature Rev. Cancer. ― 2011. ― Vol. 11. ― P. 85-95.
  19. Bristow R., Hill R. Hypoxia, DNA repair and genetic instability // Nature Rev. Cancer. ― 2008. ― Vol. 8. ― P. 180-192.
  20. Wang Y., Ohh M. Oxygen-mediated endocytosis in cancer // J. Cell. Mol. Med. ― 2010. ― Vol. 14. ― P. 496-503.
  21. Hill R., Marie-Egyptienne D., Hedley D. Cancer stem cells, hypoxia and metastasis // Semin. Radiat. Oncol. ― 2009. ― Vol. 19. ― Р. 106-111.
  22. Pennacchietti S. et al. Hypoxia promotes invasive growth by transcriptional activation of the met protooncogene // Cancer Cell. ― 2003. ― Vol. 3. ― Р. 347-361.
  23. Chang Q., Iurisica J., Do T., Hedley D. Hypoxia predicts aggressive growth and spontaneous metastasis formation from orthotopically grown primary xenografts of human pancreatic cancer // Cancer Res. ― 2011. ― Vol. 78. ― Р. 3110-3120.
  24. Yotnda P., Wu D., Swanson A. Hypoxic tumours and their effect on immune cells and cancer therapy // Methods Mol. Biol. ― 2010. ― Vol. 651. ― Р. 1-29.
  25. Harrison L., Blackwell K. Hypoxia and anemia: factors in decreased sensitivity to radiation therapy and chemotherapy // Oncologist. ― 2004. ― Vol. 9, №5. ― P. 31-40.
  26. Guzy R.D. et al. Mitochondrial complex III is required for hypoxia-induced ROS production and cellular oxygen sensing // Cell. Metab. ― 2005. ― Vol. 1. ― Р. 401-408.
  27. Mole D., Blancher C., Copley R. et al. Genome-wide association of hypoxia-inducible factor (HIF)-1a and HIF-2a DNA binding with expression profiling of hypoxiainducible transcripts // J. Biol. Chem. ― 2009. ― Vol. 284. ― P. 16767-16775.
  28. Luo W., Hu H., Chang R. et al. Pyruvate kinase M2 is a PHD3- stimulated coactivator for hypoxia-inducible factor 1 // Cell. ― 2011. ― Vol. 145. ― P. 732-744.
  29. Chan D., Giaccia A. Hypoxia, gene expression, and metastasis // Cancer Metastasis Rev. ― 2007. ― Vol. 26. ― P. 333-339.
  30. Moeller B., Richardson R., Dewhirst M. Hypoxia and radiotherapy: opportunities for improved outcomes in cancer treatment // Cancer Metastasis Rev. ― 2007. ― Vol. 26. ― Р. 241-248.
  31. Mullen A. et al. Preferential cytotoxicity of bortezomib toward hypoxic tumor cells via overactivation of endoplasmic reticulum stress pathways // Nature. ― 2011. ― Vol. 481. ― Р. 385-358.
  32. Wang R. et al. The antiepidermal growth factor receptor monoclonal antibody cetuximab/C225 reduces hypoxiainducible factor-1 alpha, leading to transcriptional inhibition of vascular endothelial growth factor expression // Immunity. ― 2011. ― Vol. 35. ― Р. 871-882.
  33. Semenza G. Defining the role of hypoxia-inducible factor 1 in cancer biology and therapeutics // Oncogene. ― 2010. ― Vol. 29. ― Р. 625-634.
  34. Wyckoff J., Wang Y., Lin E. et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors // Cancer Res. ― 2007. ― Vol. 67, №6. ― Р. 2649-2656.
  35. Wilson W.R., Hay M.P. Targeting hypoxia in cancer therapy // Nat. Rev. Cancer. ― 2011. ― Vol. 11. ― P. 393-410.