Ó Ф.С. Бова, О.И. Кит, А.Ю. Максимов, Н.С. Карнаухов, 2018
УДК 616.65-002-007.61-006.66:575.2
Ф.С. Бова1, О.И. Кит2, А.Ю. Максимов2, Н.С. Карнаухов2
1ГБУ Ростовской области «Областная больница №2», г. Ростов-на-Дону
2ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Минздрава России, г. Ростов-на-Дону
Бова Филипп Сергеевич ― руководитель Центра урологии, нефрологии и гемодиализа ГБУ Ростовской области «Областная больница №2»
344112, г. Ростов-на-Дону, ул. 1-й Конной Армии, д. 33, тел.: (863) 254-98-90, +7-928-957-08-06, е-mail: alald@inbox.ru
Реферат. Измерение копийности генов важно для определения молекулярных механизмов прогрессирования онкологического заболевания. Целью работы явилось исследование относительной копийности генетических локусов, ответственных за апоптоз и контроль неоангиогенеза в опухолевых тканях предстательной железы, у больных локализованным раком предстательной железы (РПЖ) с биохимическими рецидивами (БР) и без рецидивов после радикальной простатэктомии. В основную группу были включены 56 пациентов с локализованным РПЖ, у которых в течение двух лет после РПЭ выявлен БР. 60 больных локализованным РПЖ, у которых рецидив не наблюдался, составили группу сравнения. 55 пациентов, у которых операционные биоптаты предстательной железы были взяты в пределах здоровых тканей при удалении доброкачественной гиперплазии предстательной железы, объединены в контрольной группу. Определение относительной копийности генетических локусов BAX, BCL2, VEGFA, VEGFB проводили методом ПЦР реального времени. Установлено, что у пациентов основной группы в опухолевых образцах наблюдалось значительное повышение активности гена, стимулирующего неоангиогенез, а также угнетение апоптоза за счет повышения экспрессии гена BCL2. Снижение коэффициента, характеризующего соотношение относительной копийности генов с проапоптической и антиапоптической активностью BAX/BCL2 ниже 1,64, ассоциировано с риском развития БР у больных локализованным РПЖ после простатэктомии с диагностической чувствительностью 89,3% и специфичностью 88,3%.
Ключевые слова: рак предстательной железы, биохимический рецидив, прогноз, копийность генов, апоптоз, неоангиогенез.
Введение
В настоящее время ключевой проблемой рака предстательной железы (РПЖ), требующей внимания, является разработка точного и минимально инвазивного скринингового теста в дополнение к исследованию сыворотки крови на простатспецифический антиген (ПСА) для разделения пациентов с прогрессивным либо индолентным течением ракового заболевания [1, 2]. РПЖ имеет сложный патогенез, опирающийся на комплекс гормональных, генетических, молекулярных и гистологических изменений [5]. Среди генетических изменений значимую роль играет модификация копийности генов (Copy Number Variation или CNV), что приводит к усилению либо ослаблению экспрессии онко-ассоциированных генов, избыточной или недостаточной продукции белка либо некодирующей РНК [8]. Определение точного числа копий генов позволяет контролировать их экспрессию. Копийность генов можно отнести в разновидности генетического полиморфизма, когда в результате делеции и дупликации возникают хроматические перестройки [9].
Изменение копийности генов в геноме человека ассоциировано с развитием различных карциномом, включая РПЖ [3, 13]. G. Novelli et al. [12] при разработке специального андрочипа предложил использовать мониторинг экспрессии генов в 190 локусах в андрогензависимых и андрогеннезависимых клетках предстательной железы (ПЖ). Автор показал высокую прогностическую значимость предложенного метода контроля экспрессии генов для решения вопроса о прогнозе развития РПЖ. Высокую разделительную значимость по прогнозу выживаемости больных РПЖ несут также результаты исследования копийности генов в мононуклеарной фракции крови (диагностическая значимость 92%) [4, 10]. В работе Рoniah Р. еt al. [13] было отмечено, что модификация копийности 314 генных локусов уникальна для пациентов с РПЖ. Особо важное значение для прогноза развития РПЖ имело исследование копийности генов в локусах 1q21.3, 15q15, 7p12.1 и 12q23.1 генов ARNT, THBS1, SLC5A8 и DDC. Снижение числа копий в локусе 8p11.21 гена SFRP1 характеризовало наибольшее прогностическое значение и сопровождалось секрецией цитокинов, стимулирующих пролиферацию эндотелиальных клеток.
Если гены ассоциированы с прогрессией опухоли, то измерение их копийности важно для определения молекулярных механизмов прогрессирования онкологического заболевания. Путем изменения копийности генов контролируется экспрессия генов-супрессоров опухолевого роста [7]. Сопоставление точного числа копий определенных генов и последующего течения болезни помогает определить предикторные возможности метода.
Целью работы явилось исследование относительной копийности генетических локусов, ответственных за апоптоз и контроль неоангиогенеза в опухолевых тканях ПЖ, у больных локализованным РПЖ с биохимическими рецидивами (БР) и без рецидивов после радикальной простатэктомии (РПЭ).
Материал и методы исследования
Работа выполнена в Центре урологии, нефрологии и гемодиализа, патологоанатомическом отделении ГБУ Ростовской области «Областная больница №2», отделении онкоурологии, патологоанатомическом отделении ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Минздрава России в 2015-2018 гг. Исследование было одобрено Локальным независимым этическим комитетом ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Минздрава России.
Всем пациентам в сыворотке крови исходно и каждые 3 месяца после РПЭ определяли содержание ПСА путем иммуноферментного анализа на фотометре «Multiscan-Р 2» (Thermo Fisher Scientifi c Inc., Финляндия). Основанием для заключения о БР были: превышение концентрации ПСА в крови более 0,2 нг/мл в трех последовательных измерениях, проведенных с интервалом 2-х и более недель.
В основную группу были включены 56 пациентов с локализованным РПЖ, у которых в течение двух лет после РПЭ выявлен биохимический рецидив. 60 больных локализованным РПЖ, у которых рецидив не наблюдался, составили группу сравнения. 55 пациентов, у которых операционные биоптаты ПЖ были взяты в пределах здоровых тканей при удалении доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ДГПЖ), объединены в контрольной группу.
Возраст больных РПЖ колебался от 57 до 74 лет, составив в среднем в основной группе 66,7±2,1 лет, группе сравнения ― 62,4±2,5 года. В контрольной группе средний возраст соответствовал 63,1±2,4 года. Распределение больных в основной группе в зависимости от клинической стадии РПЖ было следующим: сТ1с ― 3/56 (5,3%), сТ2а ― 5/56 (8,9%), сТ2b ― 21/56 (37,5%), сТ2с ― 27/56 (48,2%). Высокая степень гистопатологической дифференцировки (≤6 баллов по шкале Глисона) встречалась у 6/56 (10,7%), умеренная (7 баллов по шкале Глисона) ― у 45/56 (80,4%) и низкая (8-10 баллов по шкале Глисона) ― у 5/56 (8,9%) больных.
В группе сравнения стадии РПЖ было следующим: сТ1с ― 3/60 (5%), сТ2а ― 3/60 (5%), сТ2b ― 21/60 (35%), сТ2с ― 33/55 (55%). Высокая степень гистопатологической дифференцировки (≤6 баллов по Глисону) встречалась у 8/60 (7,1%), умеренная (7 баллов по Глисону) ― у 48/60 (91,6%) и низкая (8-10 баллов по Глисону) ― у 4/60 (1,3%) больных.
Кусочки ПЖ после хирургических вмешательств помещали в 4% раствор забуференного формалина и отправляли в патологоанатомическое отделение. Операционный материал хранили не более 24 часов. При микроскопическом исследовании фиксированных образов ткани железы с окраской гемотоксилин-эозином отмечали гистологический тип опухоли, степень гистопатологической дифференцировки. У всех больных основной группы и группы сравнения гистологический тип опухоли ПЖ был представлен аденокарциномой.
В зависимости от риска рецидива РПЖ 116 пациентов основной группы и группы сравнения после операции были разделены на четыре подгруппы: очень низкого (n=4), низкого (n=10), промежуточного (n=93) и высокого риска (n=9) согласно общепринятой классификации D’Amico с соавт. [6].
С помощью метода ПЦР в реальном времени контролировали активность транскрипции в локусах генов, кодирующих синтез сосудистого эндотелиального фактора роста (Vascular endothelial growth factor, VEGF) VEGF типа A (RTPrimer DB ID 2803) и гена VEGF типа B (RTPrimer DB ID 2804). Кроме того, определяли копийность генов, контролирующих апоптоз: антиапоптозного гена, контролирующего синтез BCL2 ― протеина (B-cell lymphoma 2) (RTPrimer DB ID 1545); проапоптозного гена BAX, ответственного за синтез ассоциированного с Bcl-2 белка X (RTPrimer DB ID 1541).
Для проведения генетических исследований геномную ДНК экстрагировали путем использования фенол-хлороформной экстракции из свежезамороженных биоптатов тканей ПЖ в присутствии лизирующего SDS-содержащего буфера и протеиназы-К. Содержание полученной ДНК контролировали на флюориметре Qubit 2.0® (Invitrogen, США) с использованием набора Quant-iT™ dsDNA High-Sensitivity (HS) Assay Kit (Invitrogen, США). Нормализацию ДНК для проведения ПЦР реального времени доводили до уровня 2 нг/мкл.
При осуществлении метода ПЦР использовались прямые и обратные праймеры с учетом референтных последовательностей ДНК, предоставленных базой данных GenBank Национального центра биотехнологической информации США (табл. 1).
Таблица 1. Панель праймеров для измерения относительной копийности генов
Ген |
№ в базе данных GenBank NCBI |
Хромосомный локус |
BAX |
NM_138761.3 |
19q13.3–q13.4 |
BCL2 |
NM_000633.2 |
18q21.3 |
VEGFA |
NC_000006.12 |
6p21.1 |
VEGFB |
NM_011697.3 |
11g13.1 |
Каждые 25 мкл ПЦР-смеси содержали 10 нг геномной ДНК, по 100 наномолярного раствора прямого и обратного праймера референтного гена или гена-мишени, 0,2 миллимолярной смеси дезокситрифосфатов, ПЦР-буфер, 2,5 ммоль MgCl2, 0,05 u/мкл ДНК-полимераза Thermus aquaticus («Синтол», Россия), краситель SYBR®Green I (Invitrogen, США).
Последовательно проводилась трехкратная одновременная амплификация гена-мишени и референтного гена (гена с постоянной экспрессией) в экспериментальных и контрольных образцах, изучение соотношения сигналов от амплификатов. Вывод об изменении дозы гена делается на основании соотношения сигналов от амплификатов.
Для проведения ПЦР реального времени использовали термоциклер Bio-Rad CFX96 (Bio-Rad, USA), специализированное программное обеспечение Bio-Rad CFX Manager (ver. 2,1). Усредненные показатели для каждого исследуемого гена соотносили с аналогичным показателем референтного гена и определяли ΔCt как разность значений пороговых циклов для исследуемого и референтного гена. Расчет относительной копийности генетического локуса (RQ) определяли по формуле 2-ΔCt [11]. На следующем этапе для каждого генетического локуса и значений RQ опухолевых и контрольных образцов тканей определяли медиану, рассчитывали соотношение RQ в опухолевой ткани к RQ контрольных образцов (RQоп/RQк).
Статистическая обработка результатов проведена с помощью программы STATISTICA 10 (StatSoft, США). Количественные показатели были представлены в виде средней и ошибки средней. Различие долей анализировали с помощью четырехпольных таблиц с использованием критерия согласия Пирсона c2, Фишера. Различие средних оценивали с помощью непараметрического критерия Манна ― Уитни.
Результаты
В результате исследования в основной группе по сравнению с контрольной было обнаружено выраженное (более 1,5) и статистически значимое повышение в 3,1 раза (p<0,05) относительной копийности гена, регулирующего неоангиогенез (VEGFA), а также повышение соотношения медиан относительной копийности локуса антиапоптического гена BCL2 на 40% (p<0,05) (рис. 1). При сравнительном анализе относительной копийности генов в опухолевых образцах ткани в основной группе по сравнению с группой сравнения установлено повышение (p<0,05) относительного показателя для гена VEGFA (в 2,4 раза), BCL2 (в 1,8 раза) и снижение (p<0,05) соотношения медиан для проапоптического гена BAX на 37%. Относительная копийность гена VEGFВ в основной группе и группе сравнения не отличалась (p<0,05) от контрольной группы.
Рис. 1. Соотношение медиан относительной копийности генов VEGFA VEGFB, BAX и BCL2 в ткани ПЖ в основной группе (Осн. гр.) и группе сравнения (Гр. срав.) по отношению к контрольным образцам (Контр. гр.) и между собой
Примечание: * ― достоверные отличия
В группе сравнения по сравнения с контрольной группой относительная копийность проапоптического гена BAX была выше в 1,6 раза (p<0,05), а для антиапоптического гена ВCL2 отмечалась недостоверная тенденция к снижению (р=0,09).
Таким образом, у пациентов с локализованным РПЖ при отсутствии БР после РПЭ исходно повышение копийности гена BAX способствовало активации процессов апоптоза. У пациентов с локализованным РПЖ при последующем рецидивировании изначально в опухолевых образцах наблюдалось значительное повышение активности гена, стимулирующего неоангиогенез, а также угнетение апоптоза за счет повышения экспрессии гена BCL2.
Поскольку у больных с РПЖ по сравнению с контрольной группой, а также в зависимости от течения заболевания изменение экспрессии проапоптического гена BAX и антиапоптического гена BCL2 происходило непропорционально, то расчет соотношения относительной копийности этих генов позволил понять тренд изменений, способствующих либо ограничивающих апоптоз в опухолевой ткани (табл. 2).
Таблица 2. Соотношение относительной копийности генов с проапоптической и антиапоптической активностью у пациентов клинических групп
Группа |
BAX/BCL2 (M±m) |
p |
|
Осн. гр. |
Гр. срав. |
||
Основная группа (n=56) |
0,94±0,06 |
|
|
Группа сравнения (n=60) |
1,93±0,03 |
0,004 |
|
Контрольная группа (n=55) |
1,07±0,01 |
0,02 |
0,001 |
Повышение коэффициента BAX/BCL2 в клинических группах способствовало активации апоптоза опухолевых клеток, а снижение коэффициента, напротив, свидетельствовало об активации антиапоптических механизмов. Анализ полученных результатов позволил установить, что копийность в локусах BAX и BCL2 в контрольной группе находилась на сбалансированном уровне и коэффициент BAX/BCL2 составил 1,07±0,01. В группе сравнения повышенная экспрессия гена BAX и снижение копийности гена BCL2 в тканевых образцах опухоли привели к активации апоптоза, коэффициент BAX/BCL2 составил 1,93±0,03. В основной группе коэффициент BAX/BCL2 снижался до 0,94±0,06 по сравнению с группой сравнения (p<0,05), что свидетельствовало об активации антиапоптических механизмов.
Для оценки прогностической значимости коэффициента BAX/BCL2 в отношении определения вероятности биохимического рецидивирования у больных локализованным РПЖ после РПЭ был использован ROC анализ. Дифференциальная точка разделения (точка cut-off) показателя BAX/BCL2, позволяющая сформировать прогноз, составила 1,64. При снижении коэффициента BAX/BCL2 ≤1,64, с диагностической чувствительностью 89,3% (доверительный интервал 78,1-96) и специфичностью 88,3% (доверительный интервал 77,4-95,2) можно статистически значимо (z=30,97, p<0,0001) заключить о высокой вероятности развития БР. При превышении коэффициента BAX/BCL2 >1,64, риск рецидива был низким. Площадь под ROC кривой соотношения диагностической чувствительности и специфичности для оценки прогностической значимости риска развития БР у больных локализованным РПЖ по коэффициенту BAX/BCL2 составила 0,961±0,015 (доверительный интервал 0,932-0,99) (рис. 2).
Рис. 2. Соотношение диагностической чувствительности и специфичности на ROC кривой с пороговой точкой cut-off коэффициента BAX/BCL2 для прогноза вероятности развития БР у больных локализованным РПЖ
На следующем этапе было изучено сопряжение между степенью риска рецидива РПЖ по классификации D’Amico, объединяющим информацию о клинической стадии РПЖ, степени гистопатологической дифференцировки по шкале Глисона, содержании ПСА в крови, и уровнем коэффициента BAX/BCL2 (табл. 3). При очень низком и низком риске рецидива по классификации D’Amico у всех больных коэффициента BAX/BCL2 был более 1,64, а при высоком риске снижался ниже 1,64. Следовательно, прогностическая значимость двух классификаторов была сходной при крайних значениях риска. При промежуточном риске рецидива по классификации D’Amico из 93 больных 57% (n=53) имели высокий, а 43% (n=47) низкий риск вероятности развития БР по величине коэффициента BAX/BCL2.
Таблица 3. Распределение больных локализованным РПЖ в зависимости от риска рецидива по классификации D’Amico и коэффициенту BAX/BCL2
Риск рецидива |
BAX/BCL2≤1,64 |
BAX/BCL2>1,64 |
Всего |
Очень низкий |
0 |
4 (100%) |
4 (100%) |
Низкий |
0 |
10 (100%) |
10 (100%) |
Промежуточный |
53 (57%) |
40 (43%) |
93 (100%) |
Высокий |
9 (100%) |
0 |
9 (100%) |
Сопряжение двух классификаций было статистически значимым, о чем свидетельствовало высокое значение критерия согласия c2 Пирсона с непараметрической поправкой (M-L Chi-square=33,15) и соответствующее p<0,001. Следовательно, основное практическое значение классификация риска БР у больных локализованным РПЖ имеет при промежуточном риске рецидива по классификации D’Amico (один из признаков ― клиническая стадия Т2в-Т2с, 7 баллов по шкале Глисона, содержание ПСА в крови 10-20 нг/мл)
Обсуждение
Проведенные исследования позволили установить, что как при развитии локализованного РПЖ, так и при развитии БР в опухолевой ткани происходит активация гена VEGFA и усиленная секреция сигнального белка для стимуляции васкулогенеза. Избыточная экспрессия VEGFA способствует росту кровеносных сосудов опухоли и прогрессирующему ее течению. Ведущую роль в стимуляции ангиогенеза играет регуляторный белок VEGFA. В систему белков семейства VEGF входит также белок VEGFB, обеспечивающий в основном эмбриональный ангиогенез, главным образом, в миокарде. Экспрессия сигнального белка VEGFB не нарушалась в опухолевой ткани ПЖ как в основной группе, так и группе сравнения. Развитие БР у больных локализованным РПЖ было ассоциировано с высоким трехкратным приростом копийности гена VEGFA.
Как известно, прогрессивное развитие злокачественных опухолей связано с изменением устойчивости клеток к запрограммированной гибели. Усиление апоптоза опухолевых клеток способствует стабилизации злокачественного заболевания. Проапоптический белок ВАХ является антагонистом по отношению к свойству BCL-2, способствует пролонгации апоптозного каскада реакций. Про- и антиапоптические механизмы, как и любые сигнальные пути, находятся во взаимосвязи друг с другом. Баланс про- и антиапоптозных механизмов в тканях опухоли динамично изменяется. В связи с этим, прогностической значимостью обладают не столько абсолютные либо относительные показатели активности транскрипционной активности генов, а сколько соотношение между экспрессией про- и антиапоптозных сигнальных белков. В связи с этим, в нашем исследовании был введен коэффициент, характеризующий соотношение относительной копийности генов с проапоптической и антиапоптической активностью BAX/BCL2. У больных локализованным РПЖ с последующим развитием БР исходно соотношение относительной копийности генов с проапоптической и антиапоптической активностью BAX/BCL2 было снижено за счет усиления экспрессии белка BCL2 в опухолевой ткани. В группе сравнения соотношение копийности генов BAX и BCL2 было смещено в сторону преобладания активности проапоптозного локуса BAX, превышающего аналогичный показатель гена BCL2. Следовательно при отсутствии рецидивов у пациентов проапоптозные гены по активности преобладали над антиапоптозными. В основной группе антиапоптозные механизмы усиливались по отношению к проапоптозным. Снижение коэффициента BAX/BCL2 ниже 1,64 было ассоциировано с риском развития БР у больных локализованным РПЖ. Разработанный механизм прогнозирования обладал наибольшей практической значимостью при промежуточном риске развития рецидивов по классификации, опирающейся на сведения о стадии заболевания, степени дифференцировки и концентрации специфического маркера заболевания в крови. В связи с этим, оценка относительной копийности генов, регулирующих апоптоз в опухолевой ткани, может эффективность использоваться для повышения достоверности прогноза рецидива РПЖ.
Заключение
Установлено, что у пациентов основной группы в опухолевых образцах наблюдалось значительное повышение активности гена, стимулирующего неоангиогенез, а также угнетение апоптоза за счет повышения экспрессии гена BCL2. Разработана система дополнительного прогноза рецидива РПЖ при промежуточном риске по классификации D’Amico, основанная на оценке в операционных биоптатах баланса относительной копийности генов BAX/BCL2, регулирующих апоптоз с диагностической чувствительностью 89,3% и специфичностью 88,3%.
Конфликт интереса по представленной статье отсутствует.
Литература
1. Говоров А.В., Васильев А.О., Ширяев А.А. и др. Актуальные методы ранней диагностики рака предстательной железы // Урология. ― 2017. ― №6. ― С. 101-106.
2. Гулиев Ф.А. Предикторы биохимического прогрессирования рака предстательной железы // Казанский медицинский журнал. ― 2017. ― №6. ― С. 890-894.
3. Кит О.И., Водолажский Д.И., Кутилин Д.С. и др. Изменение копийности генетических локусов при раке желудка // Молекулярная биология. ― 2015. ― Т. 49, №4. ― С. 658-666.
4. Коган М.И., Чибичян М.Б., Водолажский Д.И. Изменение экспрессии генетических локусов в мононуклеарной фракции периферической крови больных раком предстательной железы // Клиническая онкология. ― 2012. ― №5. ― С. 59-60.
5. Corn P.G. The tumor microenvironment in prostate cancer: elucidating molecular pathways for therapy development // Cancer management and research. ― 2012. ― Vol. 4. ― P. 183-193. doi: https://doi.org/ 10.2147/ CMAR. S32839.
6. D'Amico A.V., Whittington R., Malkowicz S.B., et al. Combined modality staging of prostate carcinoma and its utility in predicting pathologic stage and postoperative prostate specific antigen failure // Urology. ― 1997 Mar. ― Vol. 49 (3A Suppl). ― P. 23-30.
7. Engler D.A., Gupta S., Growdon W.B. et al. Genome Wide DNA Copy Number Analysis of Serous Type Ovarian Carcinomas Identifies Genetic Markers Predictive of Clinical Outcome // PLoS ONE. ― 2012. ― Vol. 7 (2). ― P. e30996.
8. Heitzer E., Ulz P., Belic J. et al. Tumor-associated copy number changes in the circulation of patients with prostate cancer identified through whole-genome sequencing // Genome Medicine. ― 2013. ― Vol. 5. ― P. 30.
9. Kader T., Goode D.L., Wong S.Q. et al. Copy number analysis by low coverage whole genome sequencing using ultra low-input DNA from formalin-fixed paraffin embedded tumor tissue // Genome Medicine. ― 2016. ― Vol. 8. ― P. 121 https://doi.org/10.1186/s13073-016-0375-z
10. Komatsu N., Matsueda S., Tashiro K. et al. Gene expression profiles in peripheral blood As a biomarker in cancer patients receiving Peptide vaccination // Cancer. ― 2012. ― Vol. 118 (12). ― P. 3208-3221.
11. Livak K., Schmittgen T. Analysis of Relative gene expression data using real-time Quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method // Methods. ― 2001. ― Vol. 25 (4). ― P. 402-428.
12. Novelli G., Ciccacci C., Borgiani P. et al. Genetic tests and genomic biomarkers: Regulation, qualification and validation // Clin. Cases Miner. Bone Metab. ― 2008. ― Vol. 5 (2). ― P. 149-154.
13. Poniah P., Zain S.M., Razack A. et al. Genome-wide copy number analysis reveals candidate gene loci that confer susceptibility to high-grade prostate cancer // Urologic Oncology. ― 2017. ― Vol. 35. ― P. 545.e1-545e11.