СИСТЕМА ФИБРИНОЛИЗА В ЦИСТАДЕНОМЕ И НА РАЗНЫХ СТАДИЯХ РАЗВИТИЯ ЦИСТАДЕНОКАРЦИНОМЫ ЯИЧНИКОВ

УДК 618.11-006.67:577.15

О.И. Кит, Е.М. Франциянц, Л.С. Козлова, Е.В. Вереникина, Ю.А. Погорелова, Н.С. Чугунова, И.С. Таварян

ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» МЗ РФ, г. Ростов-на-Дону

Козлова Лариса Степановна ― кандидат биологических наук, доцент, старший научный сотрудник ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» МЗ РФ

344037, г. Ростов-на-Дону, ул. 14 линия, д. 63, тел. +7-909-427-74-71, e-mail: super.gormon@ya.ru, 79094277471@ya.ru

 

Реферат

Введение. Злокачественные опухоли яичников не имеют явных клинических признаков, отличающих их от доброкачественных. Изучение системы фибринолиза важно для понимания биологических свойств рака яичников и поможет конкретизировать некоторые теоретические моменты, необходимые для разработки новых подходов противодействия распространению заболевания и малигнизации доброкачественных образований.

Цель работы ― изучение плазмина (П), плазминогена (ПГ), его активаторов (uPA и tPA), ингибитора PAI-1 в ткани рака яичников на I-IV стадиях развития в сравнении с доброкачественной опухолью.

Материал и методы. Методом ИФА исследован операционный материал 76 больных серозной цистаденокарциномой (T₁N₀M₀; T₂N₀M₀; T₃N_xM₀; T₄N_x-1M₀; 51,5±1,7 лет), 47 больных цистаденомой, 48,8±2,7 лет. Контролем служила морфологически неизмененная ткань яичников, удаленных по поводу миомы матки у 20 больных, 52,3±1,9 лет.

Результаты. Установлено снижение содержания ПГ во всех исследованных тканях; рост активности свободного П при T₁N₀M₀ и T₂N₀M₀, истощение ПГ и свободного П при T₃N_xM₀ и T₄N_x-1M₀; увеличение комплекса П-α₂-антиплазмин (РАР) во всех тканях, кроме T₄N_x-1M₀ и непораженного яичника при T₁N₀M₀. Найдено увеличение uPA-АГ и uPA-акт во всех исследованных тканях, относительно контроля; снижение tPA-АГ во всех тканях и увеличение tPA-акт при T₂N₀M₀ и T₃N_xM₀. PAI-1-АГ увеличивался во всех тканях, относительно контроля, при T₄N_x-1M₀ ― вдвое выше, чем в остальных опухолях. PAI-1-акт снижен во всех тканях, кроме T₃N_xM₀.

Заключение. Обнаружено сходство изменений ПГ, РАР, uPA, tPA, PAI-1 при злокачественных и доброкачественных опухолях яичников. Предполагается, что эти компоненты могут быть участниками прогрессии цистаденокарциномы и малигнизации цистаденомы.

Ключевые слова: цистаденома и цистаденокарцинома яичников, система фибринолиза.

Введение

Злокачественные новообразования яичников не имеют явных клинических признаков, отличающих их от доброкачественных опухолей. Лечение оперативное, прогноз зависит от стадии заболевания, морфологической структуры опухоли и ее дифференцировки. Заболевание бывает двусторонним в 30-100% случаев. При двусторонних опухолях, как правило, появляется асцит. 5-летняя выживаемость составляет при I стадии ― 60-90%, в зависимости от морфологической принадлежности опухоли; при II стадии ― 40-50%; при III стадии ― 11%; при IV стадии ― 5%. Около 90% всех злокачественных опухолей яичников относятся к эпителиальноклеточным. Серозные злокачественные эпителиальные опухоли (серозные цистаденокарциномы) ― самые распространенные злокачественные эпителиальноклеточные опухоли. Считается, что около 50% этих карцином развивается из доброкачественных предшественников (серозных цистаденом) и к моменту клинического проявления в 30% случаев они оказываются двусторонними [23]. Серозные цистаденокарциномы имеют, как правило, многокамерную структуру и часто прорастают на наружную поверхность капсулы. Злокачественные новообразования гонад относятся к числу агрессивных форм рака, отличающихся быстрым стихийным развитием путем имплантационного роста, возникновением гематогенных и лимфогенных метастазов.

Давно доказано непосредственное и опосредованное участие компонентов системы фибринолиза в развитии и инвазии злокачественных новообразований [13, 16]. Большое количество трудов свидетельствует о том, что дисрегуляция любого из компонентов этой системы может привести к формированию опухоли и метастазов [9]. Компоненты фибринолитической системы стали адекватными диагностическими и прогностическими маркерами, например, в раке эндометрия, молочной железы, легких, поджелудочной железы и др. [8, 9, 24]. Несмотря на многочисленность сообщений, сведения о некоторых компонентах фибринолитической системы и их взаимодействии часто весьма противоречивы. Изучение системы фибринолиза важно для понимания биологических свойств рака яичников и поможет конкретизировать многие теоретические моменты, необходимые для разработки новых подходов противодействия распространению заболевания, улучшению результатов лечения на разных стадиях его развития.

Целью настоящего исследования являлось комплексное изучение плазмина, плазминогена, его активаторов и ингибитора PAI-1 в ткани рака яичников на I-IV стадиях развития в сравнении с доброкачественной опухолью.

Материал и методы

До начала исследования получено разрешение этического комитета РНИОИ и добровольное информированное согласие всех больных на использование удаленной ткани опухолей для проведения научных исследований. Исследован операционный материал 76 больных эпителиальным раком яичников (серозная цистаденокарцинома: T₁N₀M₀; T₂N₀M₀; T₃N_xM₀; T₄N_x-1M₀; возраст 51,5±1,7 лет), 47 больных доброкачественными опухолями яичников (цистаденома, возраст 48,8±2,7 лет), поступивших на оперативное лечение в отделение онгогинекологии РНИОИ. Гистологический контроль осуществлялся во всех случаях. В ходе оперативного вмешательства производилось удаление новообразований яичников с последующим биохимическим исследованием образцов ткани опухоли. В качестве условно здоровой (контрольной) использовали ткань яичников, удаленных по поводу миомы матки (n=20, возраст 52,3±1,9 лет). Ткань опухоли гомогенизировали в стерильном физиологическом растворе, однократно замораживали/размораживали при -20°С, центрифугировали и в супернатанте определяли содержание проурокиназы, урокиназы, протромбокиназы, тромбокиназы (uPA-АГ, uPA-акт, tPA-АГ, tPA-акт), а также их ингибитора PAI-1 (PAI-1-АГ и PAI-1-акт) и плазмина, связанного с α₂-антиплазмином (РАР) методами ИФА (Technoclonе, Австрия). Содержание плазминогена (ПГ) и свободного плазмина (П) определяли спектрофотометрическим методом. Результаты пересчитывали на 1 мг влажной ткани, статистическую обработку осуществляли с помощью сертифицированной программы Statistica 10, достоверность различий определяли, используя t-критерий Стьюдента. Различия считали значимыми при р<0,05.

Результаты и обсуждение

Установлено, что наибольшим содержание ПГ было в контрольной условно здоровой ткани яичников при миоме матки, в ткани цистаденомы оно снижено в 1,7 раза, в тканях цистаденокарциномы ― на 5,2-13,1 раз на разных стадиях развития, относительно контроля (табл. 1). Только при T₂N₀M₀ его содержание выше в 2,5 раза, чем при T₁N₀M₀, но это ниже, чем в контроле и ткани цистаденомы в 5,2 и 3 раза, соответственно.

На всех стадиях рака яичников приходилось констатировать истощение тканевого ПГ: коэффициент соотношения «предшественник/фермент» ПГ/П был 0,1-0,2 против 1,8 в контроле. D. Butera et al. [4] объясняют снижение ПГ плазмы крови расходом на образование ангиостатина и считают ПГ прямым его прекурсором. Возможно, это объяснение применимо и для тканевого плазминогена, т.к. он является единственным источником ангиостатина. Тем не менее, нарушение физиологического равновесия ПГ и П в ткани на всех стадиях развития рака яичников неблагоприятно сказывается на активности смежных ферментных систем, стабильности межклеточного матрикса и может прямо способствовать злокачественной прогрессии [8, 9]. Особенно активно происходило образование тканевого плазмина при T₂N₀M₀. Коэффициенты соотношений ПГ/П и ПГ/РАР при раке на всех его стадиях на порядок ниже, чем в ткани цистаденомы, хотя в последней они в 1,8 и в 3 раза, соответственно, ниже контроля (табл. 1).

Таблица 1. Плазминоген и плазмин в ткани яичников (M±m)

Показатель	Контроль (яичники при миоме матки,  n=20)	Цистаденома яичника (n=47)	Цистаденокарцинома яичника
			T1N0M0 (n=14)		T2N0M0 (n=18)	T3NxM0 (n=27)	T4Nx-1M0 (n=17)
			Пораженный	Непораженный
	1	2	3	4	5	6
ПГ мг/л	627,8±49,1	364,1±28,21	47,88±3,91,2	89,28±6,81,2,3	121,3±9,81,2,3,4	84,07±6,21,2,3	76,71±5,21,2,3,4,5
П мг/л	359,5±29,2	380,4±31,7	630,7±47,11,2	444,6±34,51,3	1247±96,11,2,3,4	372,1±29,13,4,5	405,3±27,23,5
РАР мкг/л	206,4±15,1	352,3±26,11	337,7±26,81	193,3±15,22,3	332,1±26,41,4	345,3±28,51,4	200,2±12,62,3,5,6
Коэффициенты соотношений
ПГ/П	1,8±0,1	1,0±0,071	0,1±0,0071,2	0,2±0,011,2,3	0,1±0,081,2,4	0,2±0,011,2,3,5	0,2±0,011,2,3,5
ПГ/РАР	3,0±0,2	1,0±0,081	0,1±0,0071,2	0,5±0,031,2,3	0,4±0,031,2,3,4	0,2±0,011,2,3,4,5	0,4±0,031,2,3,4,6
П/РАР	1,7±0,1	1,1±0,081	1,9±0,121,2	2,3±0,151,2,3	3,8±0,271,2,3,4	1,1±0,071,3,4,5	2,0±0,12,5,6

 

 

 

 

 

 

 

 

Примечание: индекс достоверности различий соответствует номеру столбца, с которым сравнивали числовые значения (р<0,01)

По содержанию плазмина, связанного с α₂-антиплазмином (РАР), можно судить как о количестве связанного фермента, так и о содержании ингибитора. При T₁N₀M₀ в непораженном яичнике и при T₄N_x-1M₀ количество образовавшегося комплекса практически совпадало с содержанием РАР в контрольной ткани, а при T₁N₀M₀ в пораженном яичнике, T₂N₀M₀ и T₃N_xM₀ было повышено, в среднем в 1,7 раза во всех случаях. При этом активность свободного П повышалась от T₁N₀M₀ (в ткани пораженного яичника) к T₂N₀M₀ ― это была максимальная величина из всех определенных случаев. В тканях T₃N_xM₀ и T₄N_x-1M₀ активность П сопоставима с таковой в контроле и цистаденоме. Плазмин, находящийся в связанном с фибрином и/или клеточными мембранами состоянии, гораздо меньше подвержен ингибированию α₂-антиплазмином: эффективность его инактивации уменьшается в 430 раз и, соответственно, многократно увеличивается время его полужизни [14].

При сравнении количества свободного и связанного плазмина в исследованных тканях яичников обращает на себя внимание постепенное нарастание активности свободного плазмина в злокачественно измененной ткани с одновременным истощением количества предшественника и, как следствие, ― понижением активности свободного фермента при T₃N_хM₀ и T₄N_х-1M₀ (табл. 1). Количество РАР, напротив, оказалось относительно стабильным во всех тканях с небольшими, иногда достоверными колебаниями. Это отражено коэффициентом соотношения двух форм плазмина П/РАР в таблице 1. В цистаденоме невысокое содержание свободного плазмина с преобладанием связанной формы РАР может свидетельствовать о защитной протеолитической реакции, связанной с реализацией санирующих и биологических свойств плазмина в межклеточных пространствах и мобилизацией α₂-антиплазмина. В цистаденокарциноме, на стадии T₁N₀M₀, в непораженном яичнике наблюдался его дефицит, относительно контрольной ткани, мы считаем возможным перераспределение фракций этого ингибитора в пораженный яичник для блокирования освобождающегося фермента. Отсутствие повышения концентрации α₂-антиплазмина (комплекса РАР в табл. 1) при росте активности свободного плазмина может быть связано и с токсическим влиянием злокачественной опухоли [20]. Авторы исследовали нарушение стабильности легочной ткани после лобэктомии и зафиксировали снижение уровня комплекса РАР в плевральном выпоте, повышение активности противосвертывающей системы у больных с нарушенной целостностью альвеолярных структур. На основании полученных данных F. Shoji et al. [20] пришли к выводу о недостаточности α₂-антиплазмина и участии плазмина в продолжающемся послеоперационном повреждении альвеолярной ткани больных после лобэктомии.

Именно плазмин, помимо своей основной функции растворения фибрина, разжижает межклеточный матрикс, повреждает гистогематические барьеры и клеточные мембраны, является непосредственным активатором прекалликреина, трипсиногена, проэластазы и остальных проферментов сериновых протеиназ, в том числе факторов роста, а также матриксных металлопротеиназ, коллагеназ и др. [3, 8]. Elena I. Deryugina, James P. Quigley [8] в своем обзоре сообщили, что плазмин необходим для активации практически всех матриксных металлопротеиназ, включая ММП-1, ММП-2, ММП-3, ММП-9, ММП-12, ММП-13 и ММП-14. Опосредованно этому способствуют активаторы плазминогена uPA и tPA, содержание и активность которых изменялись во всех исследованных образцах ткани (табл. 2).

Таблица 2. Активаторы плазминогена и ингибитор PAI-1 в ткани яичников (M±m)

В интерстиции uPA ― преобладающий фактор активации плазминогена, он способствует околоклеточному протеолизу и активации клеток через рецептор uPAR [7, 8, 19]. В исследованных нами тканях яичников его антигенная форма uPA-АГ достоверно увеличена в 1,8-4,0 раза, включая и ткань непораженного яичника при T₁N₀M₀ (табл. 2). В ткани цистаденомы его содержание превышало таковое в ткани непораженного яичника в 1,3 раза. Содержание активной формы uPA-акт также было повышенным во всех исследованных тканях яичников в 1,3-2,2 раза, но при цистаденоме это увеличение было наименьшим и достоверно отличалось от изменений при цистаденокарциноме. В содержании uPA-акт ткани цистаденомы не установлено достоверных различий только с тканью непораженного яичника при T₁N₀M₀, в обоих случаях оно превышало контрольные значения в 1,3 раза.

Система урокиназного пути активации плазминогена тесно связана с адгезией и миграцией клеток. Локализация урокиназы и плазминогена на клеточных мембранах посредством соответствующих рецепторов и сайтов связывания обеспечивает околоклеточный протеолиз, необходимый для инвазии. Урокиназа и образующийся плазмин обладают одинаковым непосредственным стимулирующим действием на клетки и опосредованным, которое связано с активацией латентных факторов роста, цитокинов, коллагеназ, ММП, а также с прямым действием этих молекул на клетку [19, 25]. Урокиназа изменяет адгезию клеток на внеклеточном и фибриногеновом матриксе, при этом действие урокиназы определяется ее протеолитическими свойствами [8]. Jingli Zhuo et al. [12] исследовали гельсолин, актинсвязывающий белок цитоскелета, ответственный за пластичность и сократительную способность клеток. Было показано, что он индуцирует экспрессию урокиназы при колоректальном раке. Раскрывая новые функции гельсолина, авторы одновременно доказали важную роль каскада uPA/uPAR в распространении опухоли прямой кишки и образования метастатических узлов. Min H.J. et al. [17] установили, что активация плазмином матриксных металлопротеиназ вызывает инвазию раковых клеток через активацию uPA. Elena I. Deryugina, James P. Quigley [8] представили доказательства того, что uPA участвует в туморогенезе рака эндометрия, причем высокая экспрессия uPA ассоциируется с быстрым прорастанием и метастазированием опухоли. Chia-Yen Huang et al. [6] подтвердили их выводы, доказав, что при раке эндометрия высокая экспрессия uPA повышает инвазивную способность опухолевых клеток. В своем исследовании авторы сообщают, что uPA в тканях рака экспрессируется более высоко, чем в гиперпластических и нормальных тканях эндометрия. Перечисленные исследования демонстрируют прямую связь между увеличением экспрессии uPA и способностью опухоли и метастазов рака эндометрия к прогрессии. L. Tang, X. Han [22], изучая рак молочной железы, пришли к выводу об участии урокиназы в его метастазировании. Урокиназа имеет очень низкое сродство к фибрину, однако присутствие фибрина, клеточных мембран и микровезикул, выделяемых клетками эндотелия, повышает ее активность в отношении плазминогена [14].

J. Halámková et al. [11], B.J. McMahon, H.C. Kwaan [15] считают феномен резкого увеличения внутриопухолевой урокиназы универсальным для многих злокачественных новообразований. Активность урокиназы контролируется серпином PAI-1, который имеет сродство не только к uPA, но и к tPA [11, 21].

Тромбокиназа (tPA) является трансмембранным гликопротеином и локализована, в основном, в эндотелиальных клетках. Баланс «профермент/фермент» tPA-АГ/tPA-акт был достоверно понижен во всех исследованных тканях яичников, включая непоражённый яичник при T₁N₀M₀, при этом степень его снижения резко увеличивалась на стадиях T₂N₀M₀ и T₃N_хM₀. При T₄N_х-1M₀ мы наблюдали внезапное повышение коэффициента tPA-АГ/tPA-акт за счет резкого снижения содержания tPA-АГ и, как следствие, наличия практически следовых количеств tPA-акт в ткани, по-видимому, в связи с прекращением его образования (табл. 1, 2). Опираясь на эти данные, можно утверждать, что в злокачественно перерожденной ткани яичников, по мере развития опухоли, образование tPA-акт активизируется на ранних стадиях и прекращается на стадии T₄N_х-1M₀, в связи с истощением профермента.

В ткани цистаденомы также регистрировалось снижение tPA-АГ и tPA-акт с уменьшением коэффициента соотношения неактивной и активной форм в 1,4 раза, и достоверными его отличиями от коэффициентов tPA-АГ/tPA-акт на стадиях T₂N₀M₀-T₄N_х-1M₀.

Тканевой активатор плазминогена теперь рассматривается многими исследователями как один из ферментов, вовлекаемых в процессы деструкции базальной мембраны, внеклеточного матрикса и инвазии клеток, в настоящее время уточняются детали его взаимодействия с PAI-1 [19, 21, 26].

PAI-1 является чрезвычайно важным серпином со сложными свойствами, сообщалось, что его избыточная экспрессия связана с высоким риском образования метастазов [18]. Авторами измерена биодоступность PAI-1 и сделан вывод о том, что быстрее всего PAI-1 связывается с uPA, теряя при этом значительную часть своей активности. В наших исследованиях баланс PAI-1-акт/uPA-акт уменьшался в 2,5 раза в доброкачественной опухоли яичников, сравнительно с контролем, и в 1,6-4,4 раза при раке, включая и непораженный яичник при T₁N₀M₀ (табл. 2). Наименьшим соотношение PAI-1-акт/uPA-акт было в пораженном яичнике при T₁N₀M₀, последовательно увеличиваясь к стадии  T₄N_х-1M₀. Соотношение PAI-1-акт/tPA-акт также уменьшалось во всех исследованных тканях, кроме T₄N_х-1M₀, где оно было увеличено на порядок, сравнительно с контролем. При этом данные PAI-1-акт/tPA-акт непораженного яичника при T₁N₀M₀ не имели достоверных отличий от таковых в ткани цистаденомы.

Собственный баланс антигенной формы PAI-1 с активной (PAI-1-АГ/PAI-1-акт) был достоверно увеличенным во всех исследованных тканях за счет повышенного содержания PAI-1-АГ в 1,4-2,8 раза, относительно контроля, включая и непораженный яичник при T₁N₀M₀.

Из данных литературы следует, что содержание PAI-1 в туморозном очаге при многих локализациях рака достоверно повышено, сравнительно с гистологически неизмененной тканью [5, 10]. Авторы подчеркивают, что высокая концентрация PAI-1 в опухолевой ткани не только не снижает ее агрессивность, но ухудшает течение заболевания у больных раком толстой и прямой кишки, желудка, молочной железы, яичников и др., и предлагают использовать PAI-1 в качестве прогностического маркера течения злокачественного процесса. Наши результаты согласуются с наблюдениями этих и других исследователей и подтверждают возможность защиты опухолевых клеток ингибитором PAI-1 от разрушения эндогенными и ассоциированными с опухолью протеиназами. В свете последних сообщений, резко повышенное содержание PAI-1 в исследованных нами тканях цистаденомы и цистаденокарциномы яичников скорее может служить показателем агрессивности злокачественных опухолей и возможности малигнизации доброкачественных, чем фактором эндогенной защиты. Ранее мы регистрировали дисбаланс между тканевыми серпинами, а также серпинов с активаторами плазминогена при аденокарциноме толстой кишки [1], а также в ликворе больных глиобластомой головного мозга [2]. Во всех случаях повышение содержания серпинов ткани и ликвора было связано с ухудшением состояния больного, а значения, близкие к нормальным, встречались только у больных с благополучным течением послеоперационного периода.

Заключение

Анализируя полученные результаты, мы пришли к выводу о том, что в развитии и цистаденомы, и цистаденокарциномы есть общие черты, заключающиеся в повышении антигенных форм uPA, PAI-1, снижении ПГ, tPA-АГ, вплоть до их истощения при T₄N_х-1M₀ и нарушении физиологического равновесия всех изученных предшественников с их активными формами в исследованных тканях. Изменения свободного и связанного плазмина, обоих активаторов ПГ и PAI-1 в непоражённом яичнике при T₁N₀M₀ практически аналогичны таковым при цистаденоме яичника. По многим данным плазмин многократно более эффективен, чем трипсин, в лизисе белков экстрацеллюлярного матрикса in vivo [8]. В развитии и цистаденомы, и цистаденокарциномы яичников uPA, PAI-1 и свободный плазмин играют, по-видимому, ведущую роль. Изменения фибринолиза при раке яичников отражаются в показателях активности не только ферментов системы общего и специфического протеолиза, но и белков, ограничивающих протеолитические реакции. Активированные ферменты сами оказываются активаторами других белков, формируя тем самым сложные и многокомпонентные активационные каскады, регулирующие важнейшие пути метаболизма на стадиях развития рака яичников. Возможно, направленное избирательное воздействие на uPA, PAI-1, плазмин на ранних стадиях может быть полезно в лечении цистаденомы и рака яичников.

Выводы

1. Концентрация uPA-акт и PAI-1 в тканях цистаденомы и цистаденокарциномы яичников была достоверно выше, чем в контрольной ткани яичников, во всех случаях нарушен баланс между проферментом и ферментом, а также между антигенной и активной формами ингибитора.
2.  Содержание tPA было снижено от контроля в цистаденоме, на стадиях T₁N₀M₀ и T₄N_х-1M₀ цистаденокарциномы, но на стадиях T₂N₀M₀ и T₃N_хM₀  ― выше, чем в остальных образцах ткани.
3. При цистаденоме и цистаденокарциноме яичников uPA, tPA, PAI-1 и свободный плазмин могут стать мишенями лекарственной терапии.

Литература

1. Кит О.И., Франциянц Е.М., Никипелова Е.А., и др. Изменения маркеров пролиферации, неоангиогенеза и системы активации плазминогена в ткани рака прямой кишки // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2015. 114 (2). 40-45.

2. Козлова Л.С., Франциянц Е.М., Атмачиди Д.П., Горбунова Т.А. Ингибиторы протеолиза в ликворе больных злокачественными глиомами после двух видов локальной интраоперационной химиотерапии // Злокачественные опухоли (.   ). 2014. 10 (3). 15-21.​